pET-14b大肠杆菌表达载体说明
大肠杆菌表达操作规程
大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。
3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。
4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。
5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。
二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。
培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。
2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。
3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。
4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。
5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。
6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。
7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。
8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。
9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。
三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。
2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。
3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。
4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。
大肠杆菌蛋白表达体系的构建实验报告
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化●实验目的：1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。
●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。
IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。
pET表达载体
表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。
pET 表达系统包括质粒和宿主菌。
您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。
详情请垂询。
C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-22b(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT5200 pET-‐22b(+)pet22b载体基本信息别名: pET22b, p et 22b, p ET-‐22b(+)质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5500bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG-‐3'载体标签: N-‐pelB; C-‐His载体抗性: 氨苄备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。
稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息pet22b载体简介pET-‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。
载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。
pet22b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG661 CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT TTCGCGGTAT 721 GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC CAGTAACGTT 781 ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG TGGTGAACCA 841 GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG CGGAGCTGAA 901 TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC TGATTGGCGT 961 TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA TTAAATCTCG 1021 CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG GCGTCGAAGC 1081 CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA TCATTAACTA 1141 TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG TTCCGGCGTT 1201 ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC ATGAAGACGG 1261 TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG CGCTGTTAGC 1321 GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA AATATCTCAC 1381 TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA TGTCCGGTTT 1441 TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC TGGTTGCCAA 1501 CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC GCGTTGGTGC 1561 GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA TCCCGCCGTT 1621 AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC GCTTGCTGCA 1681 ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC TGGTGAAAAG 1741 AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT 1801 AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC AACGCAATTA 1861 ATGTAAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCGG GATCTCGACC GATGCCCTTG AGAGCCTTCA 1921 ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA CTTATGACTG 1981 TCTTCTTTAT CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC ATTTTCGGCG 2041 AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA TTCGGAATCT 2101 TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC CAAACGTTTC GGCGAGAAGC 2161 AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA 2221 GGACCCGGCT AGGCTGGCGG GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG 2281 AGCGAACGTG AAGCGACTGC TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG 2341 TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA 2401 TGTTCCGGAT CTGCATCGCA GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT 2461 TAACGAAGCG CTGGCATTGA CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG 2521 CCAGTTGTTT ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA 2581 TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT 2641 ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA 2701 GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG 2761 ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT 2821 TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC 2881 TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT 2941 GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA 3001 TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA AATACCGCAC 3061 AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 3121 CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 3181 TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 3241 GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC3301 GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 3361 TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 3421 ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 3481 TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 3541 CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 3601 AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 3661 GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 3721 GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 3781 TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 3841 ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 3901 CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 3961 ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 4021 ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 4081 TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 4141 TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 4201 TTATCAGCAA 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TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG 5101 GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT 5161 GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA 5221 AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG 5281 GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT 5341 TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC 5401 GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT 5461 AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCCCATTCG CCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
pET-20b(+)载体说明
pET-20b(+)pET20b载体基本信息别名: pET20b, pet 20b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3716bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'载体标签: N-pelB信号肽, C-His载体抗性: Ampicillin备注: Hosts: E.coli. Related vectors: pBR322. 稳定性: 瞬时表达Transient组成型: 组成型Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET20b载体质粒图谱和多克隆位点信息pET20b载体简介The pET-20b(+) vector (Cat. No. 69739-3) carries an N-terminal pelB signal sequence for potential periplasmic localization, plus optional C-terminal His•Tag® sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single-stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).pET20b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGAAACCG TTGTGGTCTC CCTATAGTGA361 GTCGTATTAA TTTCGCGGGA TCGAGATCTC GGGCAGCGTT GGGTCCTGGC CACGGGTGCG421 CATGATCGTG CTCCTGTCGT TGAGGACCCG GCTAGGCTGG CGGGGTTGCC TTACTGGTTA481 GCAGAATGAA TCACCGATAC GCGAGCGAAC GTGAAGCGAC TGCTGCTGCA AAACGTCTGC541 GACCTGAGCA ACAACATGAA TGGTCTTCGG TTTCCGTGTT TCGTAAAGTC TGGAAACGCG 601 GAAGTCAGCG CCCTGCACCA TTATGTTCCG GATCTGCATC GCAGGATGCT GCTGGCTACC 661 CTGTGGAACA CCTACATCTG TATTAACGAA GCGCTGGCAT TGACCCTGAG TGATTTTTCT 721 CTGGTCCCGC CGCATCCATA CCGCCAGTTG TTTACCCTCA CAACGTTCCA GTAACCGGGC 781 ATGTTCATCA TCAGTAACCC GTATCGTGAG CATCCTCTCT CGTTTCATCG GTATCATTAC 841 CCCCATGAAC AGAAATCCCC CTTACACGGA GGCATCAGTG ACCAAACAGG AAAAAACCGC 901 CCTTAACATG GCCCGCTTTA TCAGAAGCCA GACATTAACG CTTCTGGAGA AACTCAACGA 961 GCTGGACGCG GATGAACAGG CAGACATCTG TGAATCGCTT CACGACCACG CTGATGAGCT 1021 TTACCGCAGC TGCCTCGCGC GTTTCGGTGA TGACGGTGAA AACCTCTGAC ACATGCAGCT 1081 CCCGGAGACG GTCACAGCTT GTCTGTAAGC GGATGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG 1141 CGCGTCAGCG GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG 1201 CGGAGTGTAT ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG AGTGCACCAT 1261 ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG TAAGGAGAAA ATACCGCATC AGGCGCTCTT 1321 CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG 1381 CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA 1441 TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT 1501 TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC 1561 GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT 1621 CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG 1681 TGGCGCTTTC TCATAGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA 1741 AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT 1801 ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA 1861 ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA 1921 ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT 1981 TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT 2041 TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA 2101 TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA 2161 TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT 2221 CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG 2281 CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT 2341 AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG 2401 ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC 2461 GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT TGCCGGGAAG 2521 CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT GCTGCAGGCA 2581 TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA 2641 GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA 2701 TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA 2761 ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA 2821 AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG TCAATACGGG 2881 ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG 2941 GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG 3001 CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG 3061 GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACTCATAC 3121 TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG AGCGGATACA3181 TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG 3241 TGCCACCTGA AATTGTAAAC GTTAATATTT TGTTAAAATT CGCGTTAAAT TTTTGTTAAA 3301 TCAGCTCATT TTTTAACCAA TAGGCCGAAA TCGGCAAAAT CCCTTATAAA TCAAAAGAAT 3361 AGACCGAGAT AGGGTTGAGT GTTGTTCCAG TTTGGAACAA GAGTCCACTA TTAAAGAACG 3421 TGGACTCCAA CGTCAAAGGG CGAAAAACCG TCTATCAGGG CGATGGCCCA CTACGTGAAC 3481 CATCACCCTA ATCAAGTTTT TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA AGCACTAAAT CGGAACCCTA 3541 AAGGGAGCCC CCGATTTAGA GCTTGACGGG GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG 3601 GGAAGAAAGC GAAAGGAGCG GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ACGCTGCGCG 3661 TAACCACCAC ACCCGCCGCG CTTAATGCGC CGCTACAGGG CGCGTCCCAT TCGCCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-HispRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+)pSUMO pProEXHTc pProEXHTb pProEXHTapKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+)PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEXa,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
pET14b-His-TAT-ERK2和无活性突变体pET14b-His-TAT-ERK2(AF)原核表达载体的构建和表达
Ｅ ＲＫ２ ａ ｄ ＥＲＫ （ ｎ ＡＦ）ｇ ｎ ｒ ｍｐ ｉ ｅ ｒ ｍ ｃ ｅ ｅｗｅ ｅ ａ ｌ ｉｄ ｆｏ ｐ ＤＮＡ３ Ｆｌｇ ＥＲＫ２ ａ ｄ ｐ ＤＮＡ３ Ｆｌｇ ＥＲＫ２ （ Ｆ ）ｐ ａ ｍｉ ｓ ｂ ｆ 一 ａ— ｎ ｃ 一 ａ— Ａ． ｌｓ ｄ ｙ
ｐ ｙ ｅ ａ ｅ ｃ ｉ ｅ ｃ ｉ （ ｏｌｍ ｒ ｓ ｈａｎ ｒ ａ ｔｏｎ ＰＣＲ ） ａ ｄ ｃｏｎ ｄ ｉ ｏ ｐＥＴ １ — ｉ— Ａ Ｔ ｃｏｒ Ｔｈｅ ｒ ｓ ｔｎ ｐｌｓ ｉ ｅ ｅ ｖｅ ｉｉｄ ｎ ｌ ｅ ｎｔ ４ｂ Ｈ ｓＴ ｖｅ ｔ ． ｅ ｕｌｉｇ ａ ｍ ｄｓ ｗ ｒ ｒｆｅ ｂ ｎ ｙ ｅ ｄｉｅ ｔｏｎ ａ ｄ ＤＮ Ａ ｅ ｕｅ ｃｎｇ． Ｔ ｈｅＥＲＫ ２ ａ ｙ ｅ ｚ ｍ ｇ ｓｉ ｎ ｓｑ ｎｉ ｎｄ ＥＲ Ｋ２ （ＡＦ） ｐｒ ｅｉ ｅ ｅ ｅ ｒ ｓ ｅ ｎ ＢＩ２１ （ ｏｔ ｎｓｗ ｒ ｘｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ＤＥ３）。 ａ ｄ Ｗ ｅ ｔ ｒ ｏｔｗａ ｅ ｏ ｄｅ ｅ ｔｔ ｉ ｉ ａ ｎ ｓ ｅ ｎ ｂｌ ｓ ｕｓ ｄ ｔ ｔ ｃ ｈｅ ｒＨ ｓ ｔ ｇ． Ｒｅ ｕｌ ｓ ｔ ｓ：Ｔｈｅ ｒ ｓ ｌ ｅ ｕ ｔｏｆＤＮ Ａ ｅ ｅ ｉ ｄ ｅ ｚ ｍ ｅ ｄｉ ｓ ｉｎ ｓ ｑｕ ｎｃｎｇ ａｎ ｎ ｙ ｇｅ ｔｏ ｓ ｈｏｗｅ ｈａ ｈｅｃｏｎ ｄ ＥＲＫ ２ ａ ｄ ＥＲ Ｋ２ （ Ｆ）ｇｅ ｅ ｒ ｏ ｒ ｃ ｏ ｂｅ１ ２ ｂＤ． Ｈ Ｔ— ｄ ｔ ｔｔ ｌ ｅ ｎ Ａ ｎ ｓ ｗｅ ｅｃ ｒ ｅ ｔｔ ０８ ＥＲＫ２ ａｎ Ｔ— ｄＨ ＥＲＫ ２ （ Ｆ） Ａ ｐｒ ｔ ｉ ｗ ｅ ｅ ｅ ｐｒ ｓ ｅ ｎ ＢＩ２１ （ ｏ ｅｎ ｒ ｘ ｅ ｓ ｄ ｉ ＤＥ３）， ｅ ｎ ｐｐｒ ｉ ａ ｅｙ ４１ ｋＤ． Ｈｉ ａ ｎ ｔ ｏ ｐｒ ｅｎｓｗ ａ ｅ ｉｉｄ ｂ ｅ ｔ ｂ ｉｇａ ｏｘｍ ｔ ｌ ｓｔ ｇ ｉ ｗ ｏｔ ｉ ｓｖ ｒｆｅ ｙ Ｗ ｓ — ｅ ｎ ｂｌ ． Ｃｏ ｃ ｕ ｉ ｎ：ｐＨ ｉ— ＡＴ－ ｒ ｏｔ ｎ ｌ ｓｏ ｓＴ ＥＲＫ ２ ａ ｄ ｉ— ＡＴ— ｎ ｐＨ ｓＴ ＥＲＫ２ （ Ｆ）ｉ ｃ Ａ 一ｎ ｏｍ ｐ ｎｔ ｎ ｅｍ ｕ ａ ｏｋａ ｙ ｉ ｘ ｅ ｓｏ ｅ ｅ ｃ ｔ ｎｔｐｒ ｒ ｏｔｃ ｅ ｐｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃ ｏｒ ｒ ｏｎｓ ｒ ｔ ｄ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ． Ｈ Ｔ— ｅ ｔ ｓａｅｃ ｔ ｕｃ ｅ ｓ ｃ ｅ ｓ ｕｌｙ ＥＲＫ２ ａｎ Ｔ— ｄＨ ＥＲＫ２ （ Ｆ）ｐｒ ｔ ｉ ｒ ｂｔ ｉ ｄ，ａ ｈ ｙ ｍ ｉ ｅ ｖ Ａ ｏ ｅｎｓ ａ ｅ ｏ ａｎｅ ｎｄ ｔ ｅ ｇｈｔｓ ｒ ｅ
pET-21a(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-21a(+)编号 载体名称北京华越洋生物VECT4170 pET-‐21a(+)pET21a载体基本信息别名: pET21a, p et 21a质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5443bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: N-‐T7, C-‐His载体抗性: Ampicillin备注: Same a s p ET24abcd(+) b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS; T he f1 o riginis o riented s o t hat i nfection w ith h elper p hage w ill p roduce v irionscontaining single-‐stranded DNA that corresponds to the codingstrand.稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET21a载体质粒图谱和多克隆位点信息pET21a载体简介The pET-‐21a-‐d(+) vectors carry an N-‐terminal T7•Tag® sequence plus an optional C-‐terminal His•Tag® sequence. These vectors differ from pET-‐24a-‐d(+) only by their selectable marker (ampicillin vs. kanamycin resistance). Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNApolymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage willproduce virions containing single-‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, s ingle-‐stranded s equencing s hould b e p erformed u sing t he T7 t erminator p rimer.pET21a载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGCGACCC ATTTGCTGTC CACCAGTCAT GCTAGCCATA241 TGTATATCTC CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC301 ACAATTCCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC361 CGGACGCATC GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC421 CGACATCACC GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG481 CGTGGGTATG GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC541 ACCATTCCTT GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT601 GCAGGAGTCG CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT661 TTCGCGGTAT GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC721 CAGTAACGTT ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG781 TGGTGAACCA GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG841 CGGAGCTGAA TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC901 TGATTGGCGT TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA961 TTAAATCTCG CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG1021 GCGTCGAAGC CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA1081 TCATTAACTA TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG1141 TTCCGGCGTT ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC1201 ATGAAGACGG TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG1261 CGCTGTTAGC GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA1321 AATATCTCAC TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA1381 TGTCCGGTTT TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC1441 TGGTTGCCAA CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC1501 GCGTTGGTGC GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA1561 TCCCGCCGTT AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC1621 GCTTGCTGCA ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC1681 TGGTGAAAAG AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG1741 CCGATTCATT AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC1801 AACGCAATTA ATGTAAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCGG GATCTCGACC GATGCCCTTG1861 AGAGCCTTCA ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA1921 CTTATGACTG TCTTCTTTAT CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC1981 ATTTTCGGCG AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA2041 TTCGGAATCT TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC CAAACGTTTC2101 GGCGAGAAGC AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC2161 CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA2221 CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA2281 ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC2341 TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT 2401 ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC 2461 ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA 2521 GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA 2581 AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC 2641 CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT 2701 GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC 2761 CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC 2821 ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT 2881 GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT 2941 GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA 3001 AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT 3061 CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC 3121 GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG 3181 CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG 3241 CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG 3301 ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC 3361 CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA 3421 TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT 3481 GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC 3541 CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG 3601 AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC 3661 TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT 3721 TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA 3781 GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG 3841 GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA 3901 AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT 3961 ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC 4021 GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT 4081 ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC 4141 GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC 4201 TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG 4261 TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT GCAGGCATCG TGGTGTCACG 4321 CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG 4381 ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG 4441 TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT 4501 CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA 4561 ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC 4621 ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC 4681 AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC 4741 TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC 4801 CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA 4861 ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT 4921 TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGAAAT4981 TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT 5041 TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG 5101 GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT 5161 CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC 5221 AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG 5281 ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA 5341 AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC 5401 CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCCCATTCG CCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyan pDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMO pCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPO pBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 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pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达系统使用指导
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体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
• HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白 质， 分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质 (达40g/L)， 在体内有维持血液渗透压， 运输营养和其它 重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药 物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利 用度， 增加在体内的半衰期至19d之久。
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各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀 可用亲和层析纯化 帮助可溶化 帮助分泌到周质
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pET-14b编号 载体名称北京华越洋生物VECT4150 pET-‐14bpET14b载体基本信息别名: pET14b, p et 14b质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4671bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: N-‐His, N-‐thrombin载体抗性: Ampicillin备注: Hosts: E.coli. R elated v ectors: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET14b载体质粒图谱和多克隆位点信息pET14b载体简介The p ET-‐14b v ector (Cat. N o. 69660-‐3) c arries a n N-‐terminal H is•Tag® s equence f ollowed b y a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA p olymerase i s s hown b elow.pET14b载体序列ORIGIN1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC361 CACACCCGTC CTGTGGATAT CCGGATATAG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA421 CCCGTTTAGA GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT481 CAGCTTCCTT TCGGGCTTTG TTAGCAGCCG GATCCTCGAG CATATGGCTG CCGCGCGGCA541 CCAGGCCGCT GCTGTGATGA TGATGATGAT GGCTGCTGCC CATGGTATAT CTCCTTCTTA601 AAGTTAAACA AAATTATTTC TAGAGGGAAA CCGTTGTGGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT661 TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC721 GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG781 GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG841 GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC901 AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT961 CGACCGATGC CCTTGAGAGC CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG1021 ACTATCGTCG CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG1081 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC GATGATCGGC1141 CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC AAGCCTTCGT CACTGGTCCC1201 GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG1261 GGCTACGTCT TGCTGGCGTT CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT1321 CTCGCTTCCG GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT1381 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT AACTTCGATC1441 ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG CGAGCACATG GAACGGGTTG1501 GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA1561 TGGAGCCGGG CCACCTCGAC CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA1621 CTCCAAGAAT TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT1681 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC ATCTCGGGCA1741 GCGTTGGGTC CTGGCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG1801 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA1861 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC1921 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT1981 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT2041 GGCATTGACC CTGAGTGATT TTTCTCTGGT CCCGCCGCAT CCATACCGCC AGTTGTTTAC 2101 CCTCACAACG TTCCAGTAAC CGGGCATGTT CATCATCAGT AACCCGTATC GTGAGCATCC 2161 TCTCTCGTTT CATCGGTATC ATTACCCCCA TGAACAGAAA TCCCCCTTAC ACGGAGGCAT 2221 CAGTGACCAA ACAGGAAAAA ACCGCCCTTA ACATGGCCCG CTTTATCAGA AGCCAGACAT 2281 TAACGCTTCT GGAGAAACTC AACGAGCTGG ACGCGGATGA ACAGGCAGAC ATCTGTGAAT 2341 CGCTTCACGA CCACGCTGAT GAGCTTTACC GCAGCTGCCT CGCGCGTTTC GGTGATGACG 2401 GTGAAAACCT CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC AGCTTGTCTG TAAGCGGATG 2461 CCGGGAGCAG ACAAGCCCGT CAGGGCGCGT CAGCGGGTGT TGGCGGGTGT CGGGGCGCAG 2521 CCATGACCCA GTCACGTAGC GATAGCGGAG TGTATACTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA 2581 GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG 2641 AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC 2701 GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA 2761 TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT 2821 AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA 2881 AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT 2941 CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG 3001 TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC 3061 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC 3121 GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA 3181 TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT 3241 ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC 3301 TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA 3361 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA 3421 AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA 3481 AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT 3541 TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC 3601 AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC 3661 ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC 3721 CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA 3781 AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC 3841 CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC 3901 AACGTTGTTG CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA 3961 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA 4021 GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA 4081 CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT 4141 TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT 4201 TGCTCTTGCC CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG 4261 CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA 4321 TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC 4381 AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG 4441 ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG 4501 GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG 4561 GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG 4621 ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA A//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyan pDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMO pCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPO pBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) 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