细胞培养技术在医药研究中的应用

细胞培养技术在医药研究中的应用摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药产业的发展。

动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。

利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非常重要的环节。

在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控制是细胞培养的关健技术。

关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。

自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。

因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。

全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境，并使之保持强劲的发展势头。

1 细胞培养的环境及条件1.1 无污染的环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。

1.2 适宜的温度维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。

不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。

1.3 气体环境和氢离子浓度气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。

1.4 适宜的p H 值每种细胞都有其最适p H 值。

p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。

1.5 培养基培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。

1.6 细胞培养外部环境细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。

2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。

2.1 工作环境的处理使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。

2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。

[3]细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国药典》的有关规定，清大天一制定了包括外观、溶解性、pH值、干燥失重、渗透压、细菌内毒素、微生物限度、细胞生长试验共8 个项目的细胞培养基产品的质量标准[5]。

1.1 外观用肉眼观察产品的颜色、粉末细度的均匀程度[5]。

1.2 溶解性通过对溶解于水后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的溶解性。

要求取规定量供试品，加注射用水（水温20～30 ℃）至1 L，搅拌溶解，溶液澄清[5]。

1.3 pH 值要求取规定量供试品，用注射用水（水温20℃～30℃）溶解至1 L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH 值相近的两种标准缓冲液校准pH 计后进行pH 值测定。

规定每种细胞培养基产品的pH 值允许的偏差为±0.3[5]。

1.4 干燥失重细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥失重表示产品中含湿量。

控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。

规定了细胞培养基的干燥失重为5%[5]。

1.5 渗透压细胞必须生活在等渗环境中，因此要控制培养基的渗透压范围。

规定每种细胞培养基产品渗透压值的允许偏差范围为±5%[5]。

1.6 细菌内毒素细菌内毒素是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。

培养基细菌内毒素含量过高，对生物制品的质量有很大影响，而且会降低生物制品的产率。

因此清大天一根据《中华人民共和国药典》关于疫苗、基因工程药品等注射用药须作细菌内毒素检查的规定，增加细菌内毒素检测作为细胞培养基质量标准的项目之一。

规定常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为≤10EU/ml（EU：细菌内毒素单位）[5]。

1.7 微生物限度细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。

控制细胞培养基中的细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。

规定每克细胞培养基产品中细菌数不得超过200 CFU（菌落形成单位），霉菌数不得超过50CFU。

这个标准严于《中华人民共和国药典》（2005 版）对口服给药制剂的微生物限度标准[5]。

1.8 细胞生长试验目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，参考《体外培养的原理与技术》中关于细胞计数法的论述，规定细胞在37℃恒温条件下，在含体积分数为10%小牛血清的细胞培养液中生长48～72 h，细胞形态为成纤维样，贴壁生长，72 h内细胞数量应由5×104 细胞/ml 达到1×105 细胞/ml，细胞生长48～72 h 后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养48 h，细胞形态为成纤维样，贴壁生长，细胞计数应不小于1×105 细胞/ml[5]。

一·动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少;④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高[2]。

二、动物细胞培养技术的发展动物细胞培养技术生产大分子的生物制品起始于20世纪60年代，当时是为了满足生产疫苗的需要。

后来随着培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞培养技术来生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。

因为重组DNA技术修饰过的动物细胞能够正常地加工、折叠、糖基化、转运、组装和分泌由插入的外源基因所编码的蛋白质，而细菌系统的表达产物则常以没有活性的包含体形式存在。

随着大量永生性细胞株的创建，在商业利益的刺激下，动物细胞培养技术也迅速发展起来，并被应用到生产实际。

动物细胞培养主要用于生产激素、疫苗、单克隆抗体、酶、多肽等功能性蛋白质，以及皮肤、血管、心脏、大脑、肝、肾、肠等组织器官。

它在医药工业和医学工程的发展中占重要地位。

动物细胞培养生产药物产品将是生物制药领域的一个很重要的方面，具有重大的经济效益和社会效益。

生物技术在过去10年有显著增长，并继续快速发展，今后几十年内还将有更多的蛋白质、抗体、多肽类药物由动物细胞培养来生产。

随着生物技术的进一步发展，开发的动物细胞生产生物制品的种类的增多及产品周期短、安全高等优点，利用动物细胞进行生产生物制品凸显其优越性的发展越来越快[2]。

动物细胞在生物制药研发中的重要性举足轻重,在产品研发等各个环节均获得了较大进步。

随着使用的哺乳动物细胞种类在增多,最早的哺乳动物细胞是杂交瘤细胞,这是用于生物制药中安全性较高的哺乳动物细胞。

在单抗生产中必须选择这种细胞,在药品质量日益被重视的情况下,治疗性单抗成了近几年发展最快的生物技术药物,知道1997,仅有2种治疗性单克隆抗体在美国获得了上市批准,而在近几年期间内就有15种被批准,可见发展速度之快,研究人员也对其进行了深入了解。

基因工程技术构建的工程细胞株在生物制药中不仅用于表达外源目的蛋白,同时也可以用于作为生物制药过程中的辅助细胞,如用于基因治疗产品制备辅助包装细胞。

将患者细胞经转基因处理后回输体内进行治疗,是近些年转基因细胞技术的另一个重要用途。

不论那种用途其共性技术步骤都涉及到高效工程细胞系的构建[4]。

动物细胞培养也需要注意以下一些问题:(1)工程细胞培养方式在进行构建工程细胞株时,大规模细胞进行药物生产的需求,哺乳动物细胞大规模培养方式,上述均是需要大在工程细胞株构建时就需要设计好的。

并且一些凋亡细胞能够从反应器中外排对于大规模生产也是非常重要的。

两种常用的外源启动子CMV和SV40需要细胞株能够保持一定的生长速度,培养中的细胞大多数处于S期是可以提高细胞表达产物,并使得反应器循环良好[4]。

(2)优化培养基在细胞培养过程中,培养基的作用尤为重要,是大规模生产的物质基础,蛋白、脂类、核酸、的合成均与其有密切关系,因此该项条件的优化是必要的[4]。

(3)大规模培养的监控大规模细胞培养培养过程中需要对细胞的生长速度、新陈代谢、凋亡速度进行监控。

生产中DO2和培养温度对于整个培养过程影响较大。

大量研究数据表明,培养温度下降2天后,使得S期的细胞数量明显减少 ,细胞的新陈代谢活动缓慢,部分工程细胞的死亡程度降低。

细胞培养过程的控制的本质是细胞生长、代谢、死亡速率的控制。

温度、溶氧对细胞的表达产物和细胞的生长、代谢和产物的结构具有显著影响。

实验表明,温度由37℃将至30℃后48H,S期细胞大幅度降底,G0/G1期细胞大量增加,与细胞生长速度有关的U比值同事下降,细胞凋亡推迟。

细胞产生三磷酸腺苷的活动降低了50%,总的代谢水平明显降低。

对于某些产品如促红细胞生成素,细胞的生长周期变长,一些可以水解蛋白的酶类释放速度降低,提高了促红细胞生成素的糖基化程度,可以使产品的比活得到提高[4]。

3 前景与展望细胞培养法由于其众多优点而被广泛使用，但是随着人们对细胞培养技术的进一步完善，也发现了很多不足之处。

如几乎不能反应细胞在体内的生存环境、不能表明细胞与细胞之间相互作用的干预等。

众所周之，人体中每个细胞的基因组是相同的，但是不同的组织器官中却有不同表型和功能的细胞，细胞所处的环境、周围结构及力学特征对基因表达有相当重要的影响。

培养体系具有缩短实验次数、减少药物使用量等优点。

建立细胞培养模型，就可以在很大程度上模拟体内环境，观察细胞与细胞之间的相互作用，从而弥补了单层细胞培养不能体现细胞间相互作用的缺陷，这在生命科学领域的研究和实际应用有广阔的前景。

［参考文献］[1]罗云1，孙桂波1，秦蒙1，姚帆2，孙晓波1.细胞共培养技术在医药研究中的应用 .( 1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193;2. 哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076)[2]吴旭国. 细胞大规模培养技术在生物制药中的应用. 哈尔滨三木制药厂. 黑龙江五常. 150232[3]郭树华,刘瑞明. 浅谈动物细胞体外培养的环境及条件. 金宇保灵生物药品有限公司内蒙古呼和浩特 X (0 3[4] 陈静. 细胞培养在生物制药领域中的应用. 哈药集团生物工程有限公司黑龙江哈尔滨 150025)[5]陈文庆，罗海春，邹武科. 细胞培养基的质量控制与GMP 管理. 中国医药生物技术 2007 年2 月第2 卷第1 期 Chin Med Biotechnol, February 2007, Vol. 2, No. 1 61细胞培养技术在医药研究中的应用班级：12级制药姓名：李传虎学号：1220403045。