细胞培养基本技术全面知识普及
细胞培养基本知识基本技术
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理
– 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……
实验室细胞培养基本知识
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞培养基础知识
计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许； [2] 用移液枪在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢
入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也 不要过少或带气泡； [3] 在显微镜下，用 10×物镜观察，可见细胞均匀分散计数板各处。计算四角大方格内 的细胞数，压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内(即仅计算压两个 边的细胞)，成团细胞按单个细胞计算。按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104 【注意事项】 [1] 消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 [2] 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤其要注意这一点。否则， 前后计数结果会有很大的误差。 [3] 镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团 10%以 上，说明消化不充分；或细胞数少于 2 个/mm2 或多于 50 个/mm2 时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液、计数。 5 培养细胞的运输 装运细胞的方法有两种，一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存， 保存效果较好，但较麻烦，且不宜长时间运输，多需空运。另一种简单的方法为充液法，步 骤如下： [1] 选择生长状态良好的细胞，可直接根据路程时间来选择接种细胞数量，一般以长满
【概述】
细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态，测定培养 基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞技术有血球计数板计数法和电子 细胞计数仪计数法。 【用品】
血球计数板、吸管、胰酶、培养液、显微镜
【步骤】
[1] 准备计数板：用无水乙醇或 95%乙醇清洁计数板和盖玻片，待干燥后，把盖玻片覆在
实验室细胞培养基本知识
引言：实验室细胞培养是一种重要的生命科学研究技术，通过体外培养细胞，可以模拟人体内的生理和病理状态，加深对细胞生物学和疾病机制的理解。
本文将介绍实验室细胞培养的基本知识，包括培养基的组成、细胞培养的种类、培养条件的调节等方面。
概述：实验室细胞培养是指在人工设备中，提供合适的环境条件，以维持细胞的生长和增殖。
细胞在培养基中不仅可以扩增，还可以进行各种实验室研究，如细胞凋亡、基因表达、药物筛选等。
下面将分五个大点详细介绍实验室细胞培养的基本知识。
一、培养基的组成：1.细胞培养基是由培养基基础组分和辅助组分构成的。
基础组分包括无机盐溶液、有机物、能量源、氨基酸等，辅助组分包括生长因子、激素、抗生素等。
2.常用的培养基有DMEM、MEM、RPMI1640等，其组成根据细胞类型和研究目的可有所差异。
3.细胞培养基的pH值、温度和储存条件对细胞生长至关重要，应根据细胞类型调整。
4.无菌技术在培养基制备过程中非常重要，避免细菌和真菌污染对细胞的影响。
二、细胞培养的种类：1.原代细胞培养是从组织中分离得到的初代细胞，细胞数和传代次数有限。
2.细胞株是从原代细胞培养中筛选得到的具有增殖潜能的细胞系列。
3.基于细胞的特定表型、遗传改造或药物处理的细胞系，可用于特定研究领域，如癌症研究、药物筛选等。
4.三维细胞培养技术可以模拟人体组织的三维结构和功能，提供更接近体内的环境。
三、培养条件的调节：1.细胞密度是影响细胞生长和增殖的重要因素，应根据细胞类型和实验需求进行优化。
2.培养温度应符合细胞体内温度，通常在37摄氏度下进行。
3.CO2浓度和通气情况对细胞生长至关重要，应根据细胞类型和培养基特性调节。
4.培养时间和细胞传代次数应根据培养基的要求和实验目的进行控制。
四、细胞检测与鉴定：1.细胞的染色方法是常用的细胞检测方法之一，包括细胞核染色、细胞分子染色等。
2.细胞增殖和凋亡的检测方法有CFSE染色、MTT法、流式细胞术等。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境, 在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下, 使期生长繁殖, 并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点, 它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化, 成为永久细胞系, 也可直接建成永久细胞系, 永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1.无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时, 与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力, 一旦被污染或自身代谢物质积累等, 可导致细胞死亡。
因此在进行培养中, 保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等, 是维持细胞生存的基本条件。
2.恒定的温度维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃, 偏离这一温度范围, 细胞的正常代谢会受到影响, 甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强, 温度上升不超过39℃时, 细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时, 即能受到一定损伤, 但仍有也许恢复；在40-41℃1小时, 细胞会普遍受到损伤, 仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时, 细胞受到严重损伤, 大部分细胞死亡, 个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时, 细胞所有死亡。
3.气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一, 所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环, 产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞培养技术，是生物学研究中非常重要的一个实验技术。
通过细
胞培养技术，研究人员可以将细胞在体外进行培养、繁殖和实验操作，从而深入研究细胞的生理功能、生化特性和病理变化。
细胞培养技术
的应用范围非常广泛，涉及生物医学、药物研发、基因工程、毒理学
等多个领域。
一、细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术是基于细胞的自身生存条件进行设计的。
细胞在体外
培养时，需要提供适当的生长环境，包括营养物质、生长因子、温度、湿度等条件。
在细胞培养中，通常会使用培养基来提供细胞所需的养
分和环境，培养基的种类和配方会根据不同的细胞类型和实验目的进
行选择。
二、细胞培养技术的应用领域
细胞培养技术在生物医学领域有着重要的应用，可以用于研究细胞
生长、细胞信号传导、细胞凋亡等生理过程，也可以用于筛选药物、
评估药效及毒性。
此外，在基因工程和生物技术领域，细胞培养技术
也扮演着关键角色，如基因转染、蛋白表达等方面均需要借助细胞培
养技术。
三、细胞培养技术的挑战和发展
随着科学技术的不断进步，细胞培养技术也在不断发展。
但是，细
胞培养中仍然存在一些挑战，如细胞的纯化、传代过程中的遗传变异
等问题，这些都对研究结果的准确性提出了挑战。
未来，细胞培养技术将继续向着更高效、更精准的方向发展，为生物学研究提供更多可能。
细胞培养技术作为生物学研究中不可或缺的一部分，其重要性不言而喻。
通过不断地探索和创新，相信细胞培养技术将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力，为人类的健康和生活质量带来更多的改变和进步。
细胞培养基础知识
细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。
细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究药物研究与开发(1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。
(2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。
(4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
(5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。
基础研究(1) 药物作用机理(2) 基因功能(3) 疾病发生机理2、生物制药(1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
细胞培养基本知识分享
细胞培养基本知识分享选择合适的细胞系· 种属非人类和非灵长类动物细胞系通常生物安全性限制较少，但是需要根据要开展的实验来最终决定是否要使用种属特异性培养物。
· 功能特性实验的目的是什么？例如肝脏和肾脏来源的细胞系可能更适合做毒性测试，大脑、脊髓组织来源的细胞多用于神经系统相关研究。
· 有限细胞系还是连续细胞系虽然选择有限细胞系会使您在表达正常功能时有更多的选择，但是连续细胞系往往更容易扩增和维持。
· 正常还是转化细胞转化细胞系通常生长速度较快，接种效率较高，且可连续培养，培养基中需要的血清较少，但是由于遗传转化，其表型已经发生了永久性变化。
· 生长条件和特性对细胞生长速度、饱和密度、克隆形成率以及悬浮生长能力有何要求？例如：要大量表达重组蛋白，可能应选择生长迅速且能悬浮生长的细胞系。
· 其他标准如果使用的是有限细胞系，细胞储备充足吗？细胞系的性质明确吗？需要自己进行验证吗？如果使用的是正常细胞系，有等效的正常细胞系可以作为对照吗？细胞系稳定吗？如果不稳定，那么这种细胞容易扩增以便为实验提供充足的冻存储备吗？获取细胞系可以通过原代细胞建立自己的培养系，或者也可选择从商业供应商或者非盈利性供应单位(即细胞库) 处购买已经建立的细胞系。
声誉良好的供应单位可提供优质的细胞系，而且会认真地对细胞系进行检测，以确保其完好性，并且未被污染。
我们不建议从其他实验室借用细胞，因为这会带来很高的污染风险。
无论来源如何，使用细胞之前都应确保所有新到细胞系已经过支原体污染检测。
培养环境细胞培养的一大优势在于能够控制细胞生长的物理化学环境(即：温度、pH 值、渗透压、O2 和 CO2 浓度)和生理环境(即：激素和营养素浓度)。
除温度外，培养环境均由生长培养基控制。
虽然细胞培养的生理环境不如其物理化学环境明确，但是通过对血清成分更好地了解、确定细胞增殖所需的生长因子以及更好地了解培养过程中的细胞微环境(即：细胞间相互作用、气体扩散、细胞-基质相互作用)，现在可以采用无血清培养基进行一些细胞系的培养。
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血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的除菌：购买高质量的无菌血清。不要自己试图 对血清除菌。
滴管胶头可用75％酒精浸泡5分钟，紫外线照射 消毒。
水、溶液、培养基
水：超纯水。
至少为三蒸水或去离子水。
需配制的溶液
平衡盐溶液（PBS或D-Hank’s等） 胰酶 培养基
溶液除菌方式
高压蒸汽灭菌：平衡盐溶液
过滤除菌：不能高压的溶液，如培养基、 胰酶等
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂 刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒 精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗， 再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装 好，高压灭菌，再烘干备用。
橡胶和塑料
刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。 泡入5％盐酸过夜。 自来水冲洗10次，过蒸馏水3次 烘干 高压蒸汽灭菌 烘干备用
细胞培养的应用
细胞培养的优点
1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结 构、生命活动 2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等因素 可采用各种研究技术、记录方法： 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细 胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位 素标记等。 3. 样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。 4.经济、规模和机械化
对数生长期
平台期
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期 。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时 贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、 胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促 贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因 子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团） 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜 伏期一般为6～24小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最 适合进行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再 分裂。 机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞进入平 台期。
内 容
细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制
无菌技术
原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
无菌技术
微生物污 染一直是 细胞培养 的主要问 题。
无菌技术总原则
任何时候都要毫不动摇的在每一个操作环 节都坚持高标准的无菌技术！ 预防为主！ 不要让无菌程度低的物品沾染无菌程度高 的物品！！
细胞培养基本技术
内 容
细胞培养的理论背景
设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
细胞培养的概念
20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为 的方法。 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体 内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度 和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维 持其结构和功能的一种培养技术。
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量， 用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要。
人工合成培养基只能维持细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
原代培养
传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策
原代培养
细胞分离之 后至第一次 传代之前的 细胞培养阶 段。
原 代 培 养 策 略
原代培养——分离小鼠胚胎
原代培养——分离鸡胚
原代培养—— 酶解养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养
细胞会衰退、分化、生长缓慢…………，多数情况下很难 扭转和补救。
传代培养的要诀（二） 勤观察
每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊 观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意 味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并 不大，表明有污染的可能性。 镜下观察细胞形态、生长速度。 观察培养箱水盘中的水是否干净。 观察CO2压力表。 观察液氮罐内液氮体积
无菌操作
任何时候都不要把液体从一个无菌容器倒入另一个无菌容 器。 倾倒废液时防止溅起和瓶口回流。
在视野范围内工作。
无菌技术
每人准备一套实验材料（器皿、溶液等），不 可混用。 无菌的思想贯穿到细胞培养的任何操作步骤。
内 容
细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分 开接种到新的培养器皿中。
培养细胞的生长方式
贴壁生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实 体组织来源细胞、上皮细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物 表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
贴壁细胞
贴壁细胞
贴壁细胞
贴壁细胞
悬浮细胞
细胞培养的环境
1、无污染环境：化学污染、微生物污染 2、温度环境：37℃。偏离这一温度范围，细胞的 正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低 温的耐受力较对高温强， 3、气体环境： 95%空气加5%二氧化碳 4、酸度环境：大多数细胞的适宜PH 为7.2-7.4，细 胞耐酸性比耐碱性大一些。 5、 细胞培养基：合成培养基、天然培养基。
超纯水仪
液氮罐
培养瓶、培养皿
实验器材的清洗和灭菌
清洗的重要性
1. 除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等 2. 使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。
不要让污染了的器皿变干！！
灭菌的重要性
除去微生物污染
酸液配方
新的玱璃器皿的清洗灭菌
自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 刷洗、烘干：泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗 涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿 用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次。 烘干、包装：移液管和滴管的尾端 要塞入棉花。 高压灭菌 烘干备用
细胞培养的应用
1. 药物研究与开发 (1) 新药筛选 (2) 疫苗研究与开发 (3) 基因工程药物研究与开发 (4) 细胞工程药物研究与开发 2. 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 3. 生物制药 (1) 疫苗生产 (2) 基因工程药物生产 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产
无菌程度梯度示意图
培养室的灭菌
定期打扫培养室室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦 桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或 者0.5％过氧乙酸擦拭。 CO2培养箱灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒 精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。保持培养 箱内空气干净，定期消毒。定期更换蒸馏水。 实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟 实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、 边台、倒置显微镜的载物台，打开紫外线照射20-30min
正确的工作台面布局
物品在工作台中部洁净区围成新月状，酒精灯位于中央。
保持台面整齐
Bad！
Good！
无菌操作
凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶 的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面 靠近酒精灯火焰操作。 玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必须过火灭菌 打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。 无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从 敞开的瓶口上方经过 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如 吸管不能碰到废液缸。 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。 尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。 尽可能减少开盖时间。 随时擦去任何溢出物。
培养基配制方法 （Gibico DMEM为例）
拆开包装，将包装中粉末倒入一个1L烧杯中。 用水将包装内壁的粉末冲洗入烧杯中。 加入3.7g 碳酸氢钠。 加水至900ml。 调pH值至7.4 定容至一升 过滤除菌 过滤最后取10ml置于干净的培养瓶中，放入培养箱内培养 三天，如培养基无改变，则可继续使用。 临用前加10％牛血清。