PCR设计引物时酶切位点的保护
酶切位点保护碱基
0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
>90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
10
>90
10
>90
0
50
0
50
Sph I
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
0
0
0
25
10
50
Stu I
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Xba I
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG
>90 >90 >90
>90 >90 >90
25 >90 >90
0 >90 >90
0 0 >90
10
0 50 >90
0 0 >90 50
>90 >90 >90
>90 >90 >90
Hind III
酶切位点保护性碱基的添加原则
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
0
0
>90
>90
>90
>90
Mlu I
GACGCGTC CGACGCGTCG
0
0
25
50
Nco I
CCCATGGG CATGCCATGGCATG
0
0
50
75
Nde I
CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3‘端加保护碱基，就在酶切位点识 别碱基序列（红色）的 3’端加上相应的碱基（黑色）。 2．切割率：正确识别并酶切的效率 3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
>90
10
>90
0
50
0
50
Sph I
酶切位点保护碱基
0
0
10
25
0
10
Sac I
CGAGCTCG
10
10
Sac II
GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA
0
0
50
>90
Sal I
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
0
0
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
10
50
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
25
>90
Nsi I
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
10
>90
>90
>90
Pac I
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
000250>90
Pme I
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
10
75
GAA
Sca I
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
10
25
75
酶切位点保护碱基
CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG
CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
10 〉90
0 0 0
0 0 0 75
〉90 〉90 >90
0 0 75
0 〉90 〉90
0 50
0 75
0 0 0 0 〉90 〉90
0 25 50
0 10 10 90 >90
〉90 〉90
0 25 >90
0 25 50 〉90
Pst I
Pvu I Sac I Sac II Sal I
Sca I Sma I
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
>90 〉90 >90
0 0 10
0 〉90 >90
0 25
0 50
0 0 0 0 75 75
0 10 10
0 10 10 25 25
>90 >90 〉90
〉90 >90 >90
Hae III Hind III Kpn I
Mlu I Nco I Nde I
Nhe I Not I
Nsi I Pac I Pme I
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
酶切位点保护碱基
10
>90
10
>90
0
50
0
50
Sph I
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
0
0
0
25
10
50
Stu I
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Xba I Xho I Xma I
CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG
>90
>90
>90
>90
>90
>90
>90
>90
>90
50
>90
>90
>90
>90
>90
10
25
>90
>90
>90
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0
75
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25
>90
0
0
0
0
50
>90
0
10
0
0
25
50
25
>90
0
0
0
0
>90
>90
50
50
EcoR I
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
>90
0
0
0
25
0
50
75
限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
酶切位点保护碱基
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG
GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT
AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT
10
25
90
25
>90
10
>90
>90
>90
0
0
0
25
0
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0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
Pvu I Sac I Sac II Sal I Sca I Sma I
Spe I
Sph I Stu I Xba I
Xho I
酵母培养实验
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
酶切位点保护碱基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，E coRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，N siI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，S peI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2 60单位的寡核苷酸。
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PCR设计引物时酶切位点的保护
/3953641.html
酶寡核苷酸序列
切割率%
2 hr20 hr
Acc I G GTCGAC C
CG GTCGAC CG
CCG GTCGAC CGG 0
Afl III C ACATGT G
CC ACATGT GG
CCC ACATGT GGG
>90
>90
>90
>90
Asc I GGCGCGCC
A GGCGCGCC T
TT GGCGCGCC AA >90
>90
>90
>90
>90
>90
Ava I C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamH I C GGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC GCG
10
>90
>90
25
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>90
Bgl II C AGATCT G
GA AGATCT TC
GGA AGATCT TCC
75
25
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>90
BssH II G GCGCGC C
AG GCGCGC CT
TTG GCGCGC CAA
50
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BstE II G GGT(A/T)ACC C010
BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT
25
25
50
>90
Cla I C ATCGAT G
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
>90
50
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50
EcoR I G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG >90
>90
>90
>90
>90
>90
Hae III GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA >90
>90
>90
>90
>90
>90
Hind III C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
10
75
Kpn I G GGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG
>90
>90
>90
>90
Mlu I G ACGCGT C
CG ACGCGT CG
25
50
Nco I C CCATGG G
CATG CCATGG CATG
50
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Nde I C CATATG G
CC CATATG GG
CGC CATATG GCG
GGGTTT CATATG AAACCC
GGAATTC CATATG GAATTCC
GGGAATTC CATATG GAATTCCC
75
75
>90
>90
Nhe I G GCTAGC C
CG GCTAGC CG
CTA GCTAGC TAG
10
10
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Not I TT GCGGCCGC AA
ATTT GCGGCCGC TTTA
AAATAT GCGGCCGC TATAAA
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA
10
10
25
25
10
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>90
Nsi I TGC ATGCAT GCA
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT
10
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Pac I TTAATTAA
G TTAATTAA C
CC TTAATTAA GG 0
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Pme I GTTTAAAC
G GTTTAAAC C
GG GTTTAAAC CC
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG
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Pst I G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT
10
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>90
10
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Pvu I C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA 0
10
25
10
Sac I C GAGCTC G1010
Sac II G CCGCGG C
TCC CCGCGG GGA
50
>90
Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCG
GAA
10
10
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Sca I G AGTACT C
AAA AGTACT TTT 10
75
25
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Sma I CCCGGG
C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
10
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Spe I G ACTAGT C
GG ACTAGT CC
CGG ACTAGT CCG
CTAG ACTAGT CTAG 10
10
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50
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Sph I G GCATGC C
CAT GCATGC ATG
ACAT GCATGC ATGT
10
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Stu I A AGGCCT T
GA AGGCCT TC
AAA AGGCCT TTT >90
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Xba I C TCTAGA G
GC TCTAGA GC
TGC TCTAGA GCA
CTAG TCTAGA CTAG
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75
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Xho I C CTCGAG G
CC CTCGAG GG
CCG CTCGAG CGG
10
10
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75
Xma I C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
CCC CCCGGG GGG
TCCC CCCGGG GGGA
25
50
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75
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>90
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。
加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。