引物设计心得、Primer5.0 使用
利用Primer Premier5.0来验证引物
利用Primer Premier5.0来验证引物
我们做实验，有时会用到别人已经用过的引物，但如何才能知道这个引物是否正确呢？可利用Primer Premier5.0来验证引物。
下面以常用内参GAPDH为例将验证过程介绍如下：
GAPDH的引物序列来自一片外文文献：
上游：AATGCATCCTGCACCACCAA
下游：GTAGCCATATTCATTGTCATA
所得片断为516bps。
首先在NCBI中查到GAPDH的mRNA序列。
然后打开Primer Premier5.0，点File→New→DNA Sequence,将上面的mRNA 序列复制到NewSequence 框内，注意选择as is。
先加上游引物：点Primer→点左上角s（sense)→点Edit Primers, 将上游引物复制到编辑框（用Ctrl+V快捷键），注意选择as is→点Analyze→点Prime，即可见输入的上游引物与模板匹配上了→点Ok。
再加下游引物：点左上角A（antisense)→点Edit Primers, 将下游引物复制到编辑框（用Ctrl+V快捷键），注意选择reversed→点Analyze→点Prime，即可见输入的下游引物与模板匹配上了→点Ok。
此时即可看到上游和下游引物的相关参数。
注：在Primer Premier5.0中，上游引物的显示方向为5'→3'，下游引物为3'→5'，均为从左往右看。
primer5和oligo使用技巧概况
一、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介1. 功能“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif查找。
“Premier”还具有同源性分析功能,但并非其特长,在此略过。
此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。
这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。
遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。
“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。
软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochon drion、支原体(Mycoplasma、植物线粒体(Plant Mitochondrion、原生动物线粒体(P rotozoan Mitochondrion、一般标准(Standard、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondr ion和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion。
2. 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下:其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述。
限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等,按确定即可。
常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。
你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
引物设计软件使用
一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200b p的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
primer5和oligo使用技巧概况
一、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介1. 功能“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif查找。
“Premier”还具有同源性分析功能,但并非其特长,在此略过。
此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物,由于大多数氨基酸(20 种常见结构氨基酸中的18 种的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,会遇到部分碱基的不确定性。
这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。
遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。
“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。
软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochon drion、支原体(Mycoplasma、植物线粒体(Plant Mitochondrion、原生动物线粒体(P rotozoan Mitochondrion、一般标准(Standard、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondr ion和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion。
2. 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下:其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述。
限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10 序列,-35 序列等,按确定即可。
常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。
你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
引物设计体会
我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。
我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。
产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。
二、Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
三、3’ End Stability 3 末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。
如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands）。
而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。
四、GC Clamp GC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。
这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。
它保证引物与模板的稳定结合。
选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。
五、Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。
二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。
六、Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。
发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。
自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。
primer5使用
引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（p roduct length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(inte rnal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。
利用软件PrimerPremier5_0进行PCR引物设计的研究
1基金项目2辽宁省科技厅博士启动基金(20021072)=作者简介>任亮(1978-),男,辽宁省葫芦岛市人,在读硕士研究生,主要研究方向为分子生物学。
利用软件Primer Premier 510进行PCR 引物设计的研究任 亮,朱宝芹,张轶博,王海燕,李尘远,苏玉虹,巴彩凤(锦州医学院辽宁省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室,辽宁 锦州 121001)=摘要>目的 运用Pr imer Premier 510软件设计PCR 引物,并且检验所设计引物的P CR 扩增效率和特异性。
方法 运用Primer Pr emier 510软件设计16对猪和犬的PCR 扩增引物,通过PCR 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果。
结果 在所设计的16对引物中有8对P CR 扩增特异性好且效率高,成功率50%。
但是,其中早期设计引物12对只有4对成功,后期设计引物4对全部成功。
结论 从引物设计的过程中可以看到一种趋势-后期引物设计的成功率远远高于早期。
这表明我们在引物设计方面正在逐步成熟,特别是运用比较基因组学定位的原理在分离新基因的引物设计方面积累了较多的经验。
=关键词>PCR 引物设计;软件P rimer Premier 510;P CR =中图分类号> Q 524=文献标识码> A=文章编号> 1000-5161(2004)06-0043-04T he Research of Applying Primer Premier 510to Design PCR PrimerREN Liang,ZHU Bao-qin,ZHANG Yi-bo,WANG Hai-yan,LI Chen-yuan,SU Yu-hong,BA Cai-feng(Key Laboratory of Molecular Cell Biolog y and New Drug of Liaoning Province,Jinzhou Medical College,Jinzhou 121001China)=Abstract >Objective With the help of Primer Premier 510to design PCR primer and verifying the efficiency and speciality of PCR about these primers 1Methods Sixteen pairs of primers that w ould be amplified in Genomics of pig and dog w ere designed by Primer Premier 5101The results of PCR w ould be investig ated through agarose g el electrophoresis 1Results Eight pairs of primers in all designed suc -ceeded in the efficiency and speciality of PCR,the ratio of success w as 50percent 1T he tw elve pairs of primers w hat were designed in the forepart of the ex periment were only four to amplify better 1How -ever,the four pairs of primers desig ned in the anaphase all succeeded 1Conclusions There is a trend that can be recognized in the process of designing primer 1Namely,the forepart is far more than the anaphase in the ratio of success to desig n primer 1It is indicated that our technolog y to design primer is further professional 1Moreover,the most important is that the technique route of using the com para -tive g enom ics to isolate new gene is farther comprehended and perfected and placing a direction at next experiment 1=Key words >desig n primer;Primer Prem ier 510;PCR 自从1985年美国PE-Cetus 公司的人类遗传研究室Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polym erase chain reaction;PCR)以来,PCR 已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技43锦州医学院学报J Jinzhou M ed College 2004Dec1,25(6)术手段之一。
如何使用Primer_Premier_5.0
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w .b b i o o .c o m物秀-专心做生物.b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心w w w .b b i o o .c生物秀-专心做w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做w w w .b b i o o .c o m①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分③代表这些序列与引物匹配的得分值位于50-80分，④代表这些序列与引物匹配的得分值位于80-120分生物秀-专心做生物w w .b b i o o .c o m秀-专心做生物b b i o o .c o m。
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引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用
下面以目的基因CD63 为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程
1 cd63基因序列的获取
打开NCBI-选择
输入cd63 回车
找到第16条编码为 1 的打开后可见该积基因的详细信息，找到CDS（编码序列）
可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列（146-862）复制，打开Primer 5.0
（起始密码子）ATG gc ggtggaagga ggaatgaagt gtgtcaagtt
181 tttgctctac gttctcctgc tggccttctg cgcctgtgca gtgggattga tcgccattgg
241 tgtagcggtt caggttgtct tgaagcaggc cattacccat gagactactg ctggctcgct
301 gttgcctgtg gtcatcattg cagtgggtgc cttcctcttc ctggtggcct ttgtgggctg
361 ctgtggggcc tgcaaggaga actactgtct catgattaca tttgccatct tcctgtctct
421 tatcatgctt gtggaggtgg ctgtggccat tgctggctat gtgtttagag accaggtgaa
481 gtcagagttt aataaaagct tccagcagca gatgcagaat taccttaaag acaacaaaac
541 agccactatt ttggacaaat tgcagaaaga aaataactgc tgtggagctt ctaactacac
601 agactgggaa aacatccccg gcatggccaa ggacagagtc cccgattctt gctgcatcaa
661 cataactgtg ggctgtggga atgatttcaa ggaatccact atccataccc agggctgcgt
721 ggagactata gcaatatggc taaggaagaa catactgctg gtggctgcag cggccctggg
781 cattgctttt gtggaggtct tgggaattat cttctcctgc tgtctggtga agagtattcg
841 aagtggctat gaagtaatg t ag 其中 tag（（UAG）终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标
签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！
点击 file-new-DNA sequence-将编码序列复制（ctrl V）
选择 As is
2 限制性内切酶的选择
通过查看 PcDNA3.1（+）载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。
另外pcDNA3.1（+），和（-）的含义是都是多克隆载体，只是多克隆位点区有差异，应用都是一样的，都可以做真核表达
我们可知载体上存在这些酶切位点
结合本实验室拥有哪些常用的酶选择合适的两个酶
科技楼常用 BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Pst I、Bgi II这几种酶，所以尽量选择这几种，以便省去买那些不常用的酶，造成浪费
下面看
点击 Enzyme，将刚才我们列出的几种酶从左面导入到右面，点击 OK
出现
Pst I这种酶在目的基因内部第 625个碱基出存在酶切位点，则该酶不能使用，我们可以从BamH I、Xho I、Hind III、EcoR I、Bgi II中选择两个，
两个酶切位
点之间相距不要太近，以免因为空间位阻影响酶的切割效率，上图左边为上游酶切位点，右面为下游酶切位点，上下游各选择一个，故我们可以选择Hind III 和Xho I、BamH I和Xho I、HindIII和XhoI 几种组合，又因为每种酶发挥效能时需要合适的液体环境，即Buffer，我们尽量选择两种酶都能正常使用的Buffer，见下表：
我们选择了Hind III和Xho I ，查表可知应选用 1×M Buffer
这样酶切位点和酶，buffer都选好了，下面开始设计引物
3 引物设计
点击 Primer-左上角file-preferences 可以选择引物的长度，一般是18-26个碱基，我们可以从18开始，逐渐试，以选出最优引物长度
S 代表上游引物，序列和目的基因5’端碱基序列一样，
图中显示对18个碱基的上虞噢引物的评价，里面有多个指标以评价引物质量，全是None的时候最好，如果不能满足，则至少要让False Primering这一项是None，如果都无法满足，则只能凑合用了，接下来可以设定19个、20个….碱基的长度，不一一列举了。
这样我们选择的上游引物长18bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出来5’ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3’
设计下游引物，点击 A 将滚动条拖到最右端，设定长度，再选择，结合评价选择合适的下游引物我们选择 20bp，点击 Edit Primers，可以将引物序列复制出
来5-CATTACTTCATAGCCACTTC-3下游引物其实就是目的基因序列从3’端开始的20个碱基的反向互补序列（具体可以参照基因序列自己体会）
引入酶切位点和保护性碱基（酶作用时形成粘性末端，故需在酶切位点的5’端加上几个保护性碱基，以使酶正常发挥作用）
常见酶切位点和保护性碱基
则引入酶切位点后的引物序列为
上游引物
CD63-F 5’-CCC AAGCTT GCCACC ATGGCGGTGGAAGGAGGA-3
CCC为保护性碱基，蓝色字体为 Hind III酶切位点，在酶切位点后引入kozak 序列（kozak序列存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。
核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点，GCCACC与后面ATG形成为kozak序列
下游引物
CD63-R ：5-CCG CTCGAG CATTACTTCATAGCCACTTC-3
这样我们就设计好了目的基因扩增所需的上下游引物以及为后续构建重组质粒所需的酶切位点。
下一步，PCR扩增目的基因，扩增体系，程序见前期发的心得，扩增产物经琼脂糖电泳分离，DNA胶回收试剂盒回收目的片段
分别对目的片段和pcDNA3.1 空载体行 Hind iii 、Xho I双酶切，琼脂糖电泳分离酶切后的片段，将双酶切后的载体和目的基因连接，连接产物转化 BL21，涂板，如图
pcDNA3.1 具有Amp+抗性，加入氨苄筛选阳性克隆，挑菌，扩大培养，抽提质粒，对质粒双酶切鉴定，以确定是否含有目的基因，如有，1ml 菌液送生物公司测序，如果测序结果和已知基因序列一致，则获得成功构建的重组真核表达载体 pcDNA3.1（+）-CD63
写完了，希望大家能看懂，并对当前试验有较深的理解，以及整个试验流程有个简单的认识，现在大家对所做的提质粒什么的不知道为何、有什么意义，这篇文章把我们当前所做的实验前后串了起来，可以使我们对实验有个清楚的认识，形成一条线。