设计引物软件使用方法及个人体会
引物设计心得、Primer5.0 使用
引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用下面以目的基因CD63 为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程1 cd63基因序列的获取打开NCBI-选择输入cd63 回车找到第16条编码为 1 的打开后可见该积基因的详细信息，找到CDS（编码序列）可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列（146-862）复制，打开Primer 5.0（起始密码子）ATG gc ggtggaagga ggaatgaagt gtgtcaagtt181 tttgctctac gttctcctgc tggccttctg cgcctgtgca gtgggattga tcgccattgg241 tgtagcggtt caggttgtct tgaagcaggc cattacccat gagactactg ctggctcgct301 gttgcctgtg gtcatcattg cagtgggtgc cttcctcttc ctggtggcct ttgtgggctg361 ctgtggggcc tgcaaggaga actactgtct catgattaca tttgccatct tcctgtctct421 tatcatgctt gtggaggtgg ctgtggccat tgctggctat gtgtttagag accaggtgaa481 gtcagagttt aataaaagct tccagcagca gatgcagaat taccttaaag acaacaaaac541 agccactatt ttggacaaat tgcagaaaga aaataactgc tgtggagctt ctaactacac601 agactgggaa aacatccccg gcatggccaa ggacagagtc cccgattctt gctgcatcaa661 cataactgtg ggctgtggga atgatttcaa ggaatccact atccataccc agggctgcgt721 ggagactata gcaatatggc taaggaagaa catactgctg gtggctgcag cggccctggg781 cattgctttt gtggaggtct tgggaattat cttctcctgc tgtctggtga agagtattcg841 aagtggctat gaagtaatg t ag 其中 tag（（UAG）终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，则目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！点击 file-new-DNA sequence-将编码序列复制（ctrl V）选择 As is2 限制性内切酶的选择通过查看 PcDNA3.1（+）载体图谱，选择合适的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。
primer premier5引物设计步骤
primer premier5引物设计步骤
引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短链寡核苷酸序列。
Primer Premier 5是一款常用的引物设计软件，以下是引物设计的一般步骤：
1. 目标序列准备：将目标DNA序列输入到Primer Premier 5软件中。
确保序列准确无误，并确定要扩增的目标区域。
2. 引物设计参数设置：根据实验需求和PCR反应条件，设置引物设计的相关参数。
包括引物长度、引物的GC含量、引物间的碱基对数目等。
3. 引物设计策略选择：根据需求选择合适的引物设计策略，如末端限制酶切位点、避免引物间的二聚体形成等。
4. 引物设计和评估：软件将自动生成多个候选引物序列，并根据一定的评估标准对其进行评估，包括引物的互补性、引物之间的二聚体形成、GC含量等。
5. 引物的选择和优化：根据评估结果选择一个或多个最合适的引物序列。
根据需要，可以对引物进行进一步优化，如修改引物长度、GC含量、碱基组成等。
6. 引物合成和实验验证：根据设计的引物序列进行引物合成，并进行PCR 实验验证引物的扩增效果和特异性。
引物设计是PCR实验中至关重要的步骤，引物的质量和合适性直接影响PCR 反应的效果。
Primer Premier 5软件提供了便捷的引物设计工具和功能，可以帮助研究人员高效地设计和评估引物序列。
《2024年利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》范文
《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链式反应（PCR）已成为实验室研究中不可或缺的技术之一。
PCR引物设计是PCR实验成功的关键步骤之一，它直接影响到PCR的特异性和效率。
因此，选择合适的引物设计工具对于科研工作者来说至关重要。
本文将介绍如何利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究。
二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，它能够根据用户提供的DNA序列信息，自动设计出合适的PCR引物。
该软件具有操作简便、引物设计效率高、特异性好等优点，广泛应用于分子生物学实验研究中。
三、PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的步骤1. 输入DNA序列信息：打开PrimerPremier5.0软件，将待设计的DNA序列信息输入到软件中。
2. 设置引物参数：根据实验需求，设置引物的长度、GC含量、退火温度等参数。
3. 设计引物：点击“Design Primers”按钮，PrimerPremier5.0将自动设计出符合要求的引物。
4. 评估引物：PrimerPremier5.0会给出每个引物的评估结果，包括引物的特异性、效率等。
用户可以根据评估结果选择合适的引物。
5. 输出引物信息：将选定的引物信息输出，以便进行后续的PCR实验。
四、PCR引物设计的注意事项1. 引物长度：一般来说，引物长度应在18-27bp之间，过短或过长的引物可能会影响PCR的特异性和效率。
2. GC含量：引物的GC含量应适中，一般建议在40%-60%之间，以避免因GC含量过高或过低而导致的PCR失败。
3. 退火温度：退火温度是PCR过程中非常重要的参数之一，它直接影响到引物的特异性和PCR的效率。
因此，在选择引物时，应尽量选择退火温度适中的引物。
4. 特异性：引物的特异性是PCR成功的关键因素之一，因此，在设计引物时，应尽量避免出现自我互补、错配等情况。
引物设计软件使用
3、Molecular Beacon
1 SYBR Green 法工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光， 在此阶段采集荧光信号。
好不超过2℃
四 GC含量
1 GC含量一般40-60%(45-55%)
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于 提高PCR的特异性
– GC含量太高也易于引发非特异扩增。
2 避免多个重复碱基，尤其是4或超过4个的G碱基 3 上下游GC含量需相接近
五 二级结构
1 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；
2.适用：常规PCR和 Real-time PCR
Primer express 3.0
1.ABI公司开发RealtimePCR仪器配套引 物设计软件
2.适用：Real-time PCR 局限性：
主要适用Taqman法。 考虑到“探针，及探 针与上下游引物的联 系”！条件限制很窄
四 实验设计及引物设计软件的选定
产物大小范围
引物长度
28对引物
引物分值 100分为满分
4 搜索结果
每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口 5 引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross
dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种 上述结构，因此最好的情况是最下面 的分析栏没有
But …
6 引物编辑
引物编辑
Edit primer here
oligo 使用教程及心得
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法:1，直接用键盘输入：a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence 命令，进入序列展示窗口；b，此时即可键入DNA序列；c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。
点击Edit菜单中的“Readback on”即可。
2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open 的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。
在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。
当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口,以及序列内部碱基稳定性窗口.其中的退火温度窗是我们引物设计的主窗，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。
一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。
我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。
1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs.在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC 含量有限定，d，去除错误引发引物等。
利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究
利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究引言：PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的技术，通过引物（primers）的选择和设计，能够扩增特定的DNA片段。
PCR引物设计的质量和合理性对PCR扩增的成功与否起着至关重要的作用。
PrimerPremier5.0 是一款被广泛使用的引物设计软件，具有许多功能，可以辅助研究人员选择高质量的引物。
本文旨在研究和探讨利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的方法和优势。
方法：1. 引物设计目标：在PCR实验中，为了获得准确和高效的扩增结果，引物设计时需要考虑以下几个因素：- 引物长度：通常情况下，引物的长度应在18到30个碱基对之间。
- GC含量：GC含量应尽量控制在40%到60%之间，过高或过低都会影响引物的特异性和扩增效率。
- 引物间的互补性：引物之间应避免互补性或三联体结构的形成，以避免非特异性扩增。
- 引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm值应接近，以确保特异性扩增。
2. PrimerPremier5.0软件的使用：- 安装并启动PrimerPremier5.0软件。
- 导入所需扩增区域的目标序列。
- 在软件中设置引物的参数，如长度、GC含量和Tm值等。
- 执行引物设计程序，软件会根据设置的参数，自动在目标序列中搜索合适的引物。
结果与讨论：通过PrimerPremier5.0软件的使用，可以高效地选择到符合设计要求的引物。
软件会根据设定的参数，自动搜索并筛选出多个候选引物。
1. 引物长度：为了确保引物能够与模板DNA进行特异性结合，通常将引物长度设定在18到30个碱基对之间。
经过软件筛选后，可得到一组长度适当的引物。
2. GC含量：合适的GC含量可以提高引物的稳定性和特异性。
软件会自动根据设定的GC含量范围，筛选出具有适当GC含量的引物。
引物设计软件
引物设计软件引物设计软件是一种用于设计DNA引物的软件工具。
引物是一段能够与目标DNA序列特异性结合的短链核酸，常用于PCR、测序和基因克隆等实验中。
引物设计软件帮助研究人员快速、高效地设计出合适的引物，提高实验成功率和结果准确性。
引物设计软件通常具有以下几个主要功能：1. 目标序列输入：研究人员可以将目标DNA序列输入到软件中。
目标序列可以是特定基因的片段、全基因组序列等。
2. 引物设计：软件会根据输入的目标序列，自动设计出合适的引物。
设计引物时，软件会考虑引物的长度、GC含量、互补性、目标序列内部二级结构等因素，以确保引物的特异性和稳定性。
3. 引物评估：设计好的引物需要经过一系列评估指标来判断其质量。
软件可以提供引物的峰值温度(Tm)、二级结构预测、互补性检测等功能，帮助研究人员评估引物的性能。
4. 引物优化：根据评估结果，软件可以提供引物优化的建议，如调整引物长度、更改引物序列等。
优化后的引物能够提高引物的特异性和扩增效率。
5. 引物存储：软件可以保存设计好的引物信息，方便后续的实验操作和数据记录。
与传统的引物设计方法相比，引物设计软件具有以下优势：1. 自动化：引物设计软件能够自动完成引物设计和评估的过程，大大节省了研究人员的时间和劳动力。
2. 准确性：软件可以通过算法和数据库的支持，从大量的引物和目标序列中筛选出最佳的引物，提高了设计的准确性和成功率。
3. 综合性：引物设计软件通常会整合多种引物设计算法和工具，提供多个引物设计方法和选项，帮助研究人员选择最适合自己实验的引物设计策略。
4. 可视化：软件通常会以图形界面的形式呈现引物设计结果，以便研究人员更直观地了解和分析设计的引物。
总之，引物设计软件是一种重要的工具，对于提高实验效率和科学研究的准确性具有重要作用。
未来随着技术的进一步发展，引物设计软件将会越来越智能化、自动化和个性化，为研究人员提供更好的设计和分析引物的体验。
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
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研究生必备——设计引物篇一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m 值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。
定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。
引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。
引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。
Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G 值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。
可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。
上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。
Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming 分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。
若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。
因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
二、引物设计过程中的心得1、Primer 5.0搜索引物①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。
当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
②PCR Product size最好是100－300bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。
至于上限倒也不必要求苛刻。
③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。
其它参数默认就可以了。
④引物之间Tm值的差应下雨5、引物和模板之间的Tm值差应小于20较合适。
（在设计引物过程中个人的总结）⑤搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。
当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C 太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。
对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
2、Oligo 6.0评估引物①在analyze里，Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR 退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。
②Hairpin Formation根据黄金法则③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。
在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
⑤Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。
△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
3、其他①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。
这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。
软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。
⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。
所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。