引物设计的原则以及常见引物设计软件的使用
引物设计软件使用
一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200b p的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
引物设计的原理与方法
引物设计的原理与方法引物设计是指为了在PCR、荧光定量PCR、基因克隆、基因表达、基因测序等分子生物学实验中特异性地扩增DNA序列或检测特定DNA序列而设计的一对或多对寡核苷酸。
引物设计的原理是基于两个核心要素：特异性和效能性。
特异性指引物与目标DNA序列完全互补，没有或只有微小的不匹配，以确保扩增或检测的特异性；效能性指引物的长度、GC含量、无特异结构和互补等因素需要优化，以提高PCR的效率和产物的质量。
1.模板DNA序列分析：通过对目标DNA序列进行分析，选择合适的扩增区域。
可根据目标序列的功能域、暴露度、多样性等特点进行选择。
2.引物长度和GC含量的优化：引物的长度通常在18-25个核苷酸之间，GC含量一般在40%-60%之间。
过长或过短的引物可能导致特异性和效率下降。
3.引物间的特异性检测：使用基因组数据库进行BLAST或其他比对算法的分析，检测引物是否有特异性。
确保引物的特异性是避免非特异扩增或检测的重要因素。
4. 引物设计软件的应用：目前市场上有很多引物设计软件，如Primer3、Beacon Designer、OligoAnalyzer等。
这些软件通过输入目标序列，自动生成引物并进行特异性和效能性的评估和预测。
5.引物的互补性检测：引物间的互补性会导致多聚体的形成，降低PCR效率和特异性。
可以使用软件或实验方法，如熔解曲线分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，来检测引物间的互补性。
6.实验证明和优化：设计好的引物需要经过实验证明，通过PCR或其他检测方法来验证引物的特异性和效能性。
如果引物不符合要求，可以进行引物的调整和优化。
综上所述，引物设计的原理是基于特异性和效能性，方法包括模板DNA序列分析、引物长度和GC含量的优化、引物间的特异性检测、引物设计软件的应用、引物的互补性检测和实验证明和优化。
这些方法可以帮助科研人员设计特异性和效能性较好的引物，以提高实验的成功率和准确性。
引物设计 例子
Hale Waihona Puke 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。尤其应避免3′端的 互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的 形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其 △G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生 引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能 正常进行。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结 构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。 应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低 （绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易 在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位 置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
从NCBI里面搜索基 因序列，方法如下
PCR引物设计的原则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 3.引物GC含量在40%~60%之间，上下游引物Tm差值不 大于4度。 4.引物3′端要避开密码子的第3位 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 6.碱基要随机分布。
常见生物医学 软件操作
1.引物设计 2.graphpad grism5 数据分析 3.endnote X7 插入文献 4.lightcycler@96 实时定量
1.引物设计
采用Primer Premier 5.0 进行引物设计 首先打开Primer Premier 5.0 ，输入序列
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
引物设计原则及设计软件详解
避免引物二聚体
避免引物之间形成二聚体，以减少对荧光信 号的干扰。
荧光标记
选择合适的荧光标记，以确保荧光信号的稳 定性和准确性。
引物效率
优化引物浓度和PCR反应条件，以提高扩增 效率和准确性。
案例四：测序引物设计
引物长度
测序引物长度一般为18-24个碱基， 过长或过短都会影响测序质量。
GC含量
GC含量应适中，以保证测序反应的 稳定性和准确性。
设计原理
Primer3基于引物设计的热力学原 理，结合序列特异性信息，通过 算法自动筛选符合用户需求的引 物对。
使用方法
用户需提供目标序列及引物设计 参数（如引物长度、GC含量等） ，软件将输出符合要求的引物列 表，供用户选择。
Oligo软件
Oligo概述
Oligo是一款专业的引物设计软件，适用于各种PCR实验需求，提 供高度自定义的引物设计选项。
设计原理
GeneFisher结合序列特异性信息和PCR反应原理，通过智 能算法设计具有高特异性、高效扩增能力的引物。
使用方法
用户需输入目标序列及相关参数（如引物长度、GC含量等 ），软件将生成符合要求的引物对，并提供详细的引物评
估信息。
其他引物设计软件
其他软件概述
设计原理及特点
使用方法
除了上述三款主流软件外，还有许多 其他优秀的引物设计软件可供选择， 如Primer-BLAST、PrimerExpress等 。
避免与其他序列的同源性
引物应尽量避免与其他已知序列 具有同源性，以减少非特异性扩 增的可能性。
02
引物设计原则详解
特异性原则
引物特异性
确保设计的引物能够特异性地与目标 序列结合，避免与非目标序列的交叉 反应。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
引物设计的原理和程序
引物设计的原理和程序一、设计原理1、择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。
若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为40～60％。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3’末端的互补。
二、引物设计操作流程序列下载引物设计筛选1、 序列查找根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在/pubmed 网址查询有关序列。
2、同源性比较 主要有两种方法A、在/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。
B、采用OMIGA, PCGENE 等软件进行两两或多序列比较。
1、打开OMIGA 软件，导入（import）下载存盘的纯文本序列文件：2、选择待比较的多条序列，右键点击“align sequences”命令；3、等待计算机处理，直至状态显示排列结束，点击“alignment”显示结果；4、“alignment”结果，相同碱基以同色标记三、引物设计与筛选 Primer Premier 5.0软件为例，进行引物设计和筛选的操作示范1、 打开软件，调入序列2、选择路径，选择序列文件名，加入右框3、序列文件显示如图，点击“primer”；4、按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物搜寻5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”，进入下一页；6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选。
引物设计知识点汇总图
引物设计知识点汇总图引物设计在生物学、分子生物学、遗传学和基因工程等领域中起着至关重要的作用。
引物是一种短链核酸序列，能够与待测DNA分子的特定区域发生互补配对，并作为PCR扩增的起始序列。
本文将汇总引物设计的知识点，以帮助读者更好地理解和应用引物设计技术。
一、引物设计的基本原则良好的引物设计需要遵循以下几个基本原则：1. 引物长度：引物的长度通常在18-30个碱基对左右，过长或过短都会影响扩增效率。
2. CG含量：引物的CG含量应在40-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
3. 碱基配对：引物末端3-5个碱基对应于待扩增区域的碱基，必须能够与模板DNA发生稳定的碱基配对。
4. 引物间无重叠：引物对应于待扩增区域的两端应无重叠，以免引起非特异性扩增。
5. 避免自身互补：引物序列内部不应有自身互补碱基序列的存在，以免引起二聚体结构形成。
二、引物的特殊设计要求除了基本原则外，引物设计还需根据特定应用场景和需求进行相关的特殊设计，常见的特殊设计要求包括：1. 限制性内切酶位点：为了方便下游的限制性酶切鉴定或其他目的，引物设计时可以在引物两端加入限制性内切酶位点。
2. 标签或引物标记：引物序列中可以加入氨基酸序列或引物标记，用于检测、纯化或识别等应用。
3. 引物修饰：如磷酸化、甲基化等化学修饰可以增加引物的稳定性和特异性。
三、引物设计的常见软件工具为了方便引物设计和评估，现有许多专业软件工具可用于辅助设计引物，其中常见的包括：1. Primer3: 一种广泛使用的引物设计软件，提供了多个参数选项，如引物长度、Tm（两链融合温度）、GC含量等。
2. OligoAnalyzer: 用于计算引物序列的理论Tm和二聚体结构等信息。
3. IDT PrimerQuest: 由Integrated DNA Technologies提供的在线引物设计工具，可根据需求设计引物，并评估其性能。
4. NCBI Primer-BLAST: 在NCBI数据库中进行引物设计和BLAST分析的综合工具。
PCR引物设计及Primer_Premier_5.0使用介绍
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
第四步：阅读框
NR1序列： atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct…..
5、引物序列与模板序列组成的相似性
可能的错误引发位点决定于引物序列组 成与模板序列组成的相似性，相似性高 则错误引发率高 。
引物设计的原则
6、最好在模板cDNA的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似序 列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物 种的同一基因，通过序列分析软件（比 如DNAman）比对（Alignment），各 基因相同的序列就是该基因的保守区。
Primer1: 5’
Primer1: 5’
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
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450-500 P.E.
# range. ——p70,oligo7 manual
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
与primer premier6界面类似，增加了设计引物的种类，可用于设
计各种实时定量的引物和探针，分子信标等。
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
一 前言
如何设ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ引物？
遵循引物设计的原则 设定引物的一些参数 利用引物设计软件搜索，评价引物
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二 引物设计原则
1.引物的长度
引物的长度一般选择在18-27个碱基之间，过长和过短都会降 低引物结合效率。
2.引物的Tm值
引物的Tm值一般选择在55-65℃之间，上下游引物之间Tm相差 不宜超过4℃。 Tm值：两段互补的碱基序列解链50%时的温度 估算Tm=4*(G+C)num+2*(A+T)num
此外，Beacon Designer增加了标记外显子的选项，使得方便设计跨外 显子的引物，提高实时定量引物的特异性。 Locate exon + Junction Primer serach
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
导出引物信息为表格文件-Export Results
引物设计的原则以及
常见引物设计软件的使用
伏东科 20150618
目录
一 前言 二 引物设计原则 三 常用软件使用方法
四 常见问题
一 前言
什么是引物？
引物（primer），又称引子，是一小段单链DNA或RNA，用来作 为DNA复制的起始点（终点）。
生物的DNA复制
RNA引物
聚合酶链式反应（PCR）
Any Question You Have？
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
序列编辑-edit
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
引物二级结构分析——Analyze
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
保存结果——File—>save
三 常用软件使用方法
3 Oligo7——核心参数（PE，引发效率）
PCR primers may be balanced by using their P.E. # or by their Tms. Excellent results have been obtained for multiplex PCR (10 pairs) when all the primers were within a
反应体系中引物的？
……
2.文献中的引物直接用于PCR，未扩增出条带或杂带很多 文献来源杂志的影响力和可信度？ 是否在合成引物之前用软件进行评价？
反应条件，使用仪器不同的影响？
四 常见问题
3.扩增片段大小与预期不一致 模板序列是否正确？ 模板发生突变？ 引物错配？ PCR产物测序验证
… …
Thank you！
人工合成的引物（通常为DNA引物）。
一 前言
为什么要设计引物？
1. DNA聚合酶不能从头合成DNA，在
5’
DNA复制过程中，DNA聚合酶仅仅可以
把新的核苷酸加到已有的DNA链上，在 整个过程中引物起到了提供3’OH的作
用。
2. 引物与模板DNA上某一特定位点互 补配对，决定要扩增的DNA的位置。
3’
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
选中当前引物窗口，点击菜单栏中的edit->copy可以复制当前引物， Fuction选项中的edit可以编辑当前引物，Report选项可以查看引物的 二级结构，Graph可以查看Tm，GC含量的曲线。
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
Open一个已有序列文件，或new一个序列，可以用ctrl+V快捷键
我怕中文输入法
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
点击primer进入引物设计界面，点击search设置搜索参数，OK开始 查找引物,Ok会显示查找成功的引物列表,点击选中某一对引物会出 现引物和PCR产物的详细信息
二 引物设计原则
3.引物的GC含量
引物的GC含量一般应为40%~60%，引物的GC含量影响引物的Tm值。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、 T或G、C尾巴。
3.引物的碱基随机分布
引物序列的碱基应该随机分布，避免局部GC或AT富集，避免引物内 部出现重复序列
二 引物设计原则
5.避免模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。各种引物设计软 件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。
6.引物的特异性
引物应当与模板特异性结合，避免与模板其他位置错配（false priming），尤其是引物的3’端。3’端不应超过3个连续的G或C， 因为这样会提高引物在G+C富集序列区错误引发率。
Tips：引物与模板DNA基因组BLAST
false priming
二 引物设计原则
7.避免引物间二级结构
避免引物形成发夹（Hairpin），自身二聚体（self-dimer），异
二聚体（cross-dimer）等二级结构，影响引物与模板的结合效率。
self-dimer
Hairpin cross-dimer
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6也增加了在线BLAST的功能和模板二级结构的分析
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 Oligo7是java语言编写的软件，需要正确安装java运行时环 境（JRE）
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
打开一段序列（核酸或者蛋白）
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三 常用软件使用方法
引物设计常用软件
pp5
pp6
Primer premier 系列
操作简单，容易上手
Oligo系列 oligo7
非常专业，参数更加详尽， 打分更加复杂，可以设计 多种引物
Beacon Designer 系列
BD8
实时定量引物和分子信标 设计的最佳软件
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-信息窗 显示当前的引物和选中的寡核苷酸的基本信息，以及标注的序列的特征
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-全局窗口
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-局部窗口
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
引物查找-search
三 常用软件使用方法
软件的获取
如果你热衷于Macintosh OSX
以上软件均有Macintosh版本
或者你是Linux控
你可以选择命令行下的primer3
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四 常见问题
1.软件分析无误，PCR实验出现杂带
是否与对应物种基因组进行BLAST？ 退火温度设置是否合理？ 引物长度是否过长或过短？
Primer premier6在界面上迎来了较大的改变，可以同时对多对序列设计 引物，
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6增加了引物评价的功能
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6也增加了标记SNP的功能