骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达

ABSTRACT最近我们报导了离体情况下，SMAD独立性骨形态生成蛋白4（BMP4）信号通路在造血干细胞/祖细胞（HSPCs）中活化，影响了它们导向骨髓（BM）的过程。

本文中，我们评估了活体中，影响BM龛是否会导致BMP信号传递过程发生改变。

我们揭示了注入BMP拮抗剂头蛋白（Noggin）来抑制SMAD依赖性BMP信号转导，显著增加了BM血浆中CXCL12的水平，增强了植入HSPCs的导向与血管生成。

反过来，注入BMP7而不是BMP4，造成HSPC 导向能力下降。

利用ST2细胞充当BM龛的体外模型，我们发现在中和抗BMP4抗体，NGN，或背成形因子（Dorsomorphin, DM）同时敲除掉Smad1/5及BMP4的条件下孵化，所有这些都增强了CXCL12的产生。

染色质免疫沉淀分析识别出了CXCL12启动子中与SMAD4结合的元件。

删除这个元件后，观察到CXCL12启动子活性增加，并且NGN或DM不再影响Cxcl12表达。

有趣的是，BMP7表达只出现在成骨细胞中，不出现在其它龛成分中。

因此，我们将SMAD依赖性BMP信号转导描述为BM龛中一种新的CXCL12生产调控因子，影响HSPC的导向，移植成活以及运动。

INTRODUCTION在治疗多种类型癌症，骨髓（BM）衰竭中，遗传性代谢障碍，以及严重先天性免疫缺陷时，常常使用造血干细胞（HSC）移植（1）。

在骨髓中，HSCs与其所处的微环境相互作用，这种微环境也称为“龛”。

最初提出HSCs与成骨细胞有关（2），然而后来发现许多HSCs与窦状小管内皮有关（3）。

移植后的造血重建，需要HSCs有效地导向到BM龛中。

多种从细胞分泌到BM龛中的细胞因子和生长因子调控着HSCs的维持和分化（4）。

HSCs也表达一系列黏附受体，接受BM中不同类型细胞分泌的配体，使得植入的HSCs可以导向和定居（5）。

黏附受体表达情况的改变，或其与龛中相应受体之间相互作用的改变，不止会引起HSC动员，也会使HSC难以维持（6）。

细胞因子CXCL12及其G蛋白耦联受体（GPCR）CXCR4，在造血干细胞/祖细胞迁移到BM，以及定居于龛的过程中起主要作用（7~11）。

基于Mx-cre技术，将CXCR4从成年小鼠HSCs中条件性删除，显示出CXCR4对维持原始HSCs很重要（10）。

这一相互作用对于人类及小鼠HSCs植入受辐射处理后的宿主体内后，进行导向的过程十分重要（10，11）。

由BM 龛细胞产生的一种CXCL12细胞因子浓度梯度，吸引着植入的HSCs前来，它们首先黏附于内皮并滚动，然后通过穿内皮迁移，穿入组织（12）。

根据表达CXCL12的细胞类型，CXCL12不同地影响HSCs的维持，和谱系定型祖细胞的维持（13，14）。

尽管人们做了很多工作来评估分泌出来的CXCL12的更新与失活，关于Cxcl12基因表达调控的方面仍然所知不多。

CXCL12的表达在缺氧条件下升高，这是由HIF-1α结合在其启动子上所致（15）。

诸如IL-1好IL-6这样的炎症刺激，以一种CCAAT/增强子结合蛋白β（c/EBP β）依赖性方式诱导CXCL12表达（16）。

另外，Cxcl12启动子区域，除了别的以外，还含有Sp1，AP1，NF K B，PARP1结合位点（17）。

骨形态生成蛋白（BMPs）是中胚层分化的主要调控因子，在造血系统的发育中起重要作用（18，19）。

另外，它们在骨组织的形成与动态平衡中起重要作用，这形成了关键性的BM龛（20）。

BMPs可以调控出生后时期的骨动态平衡，并调控骨量来影响成年造血过程，这一点虽然已经了解得很清楚，但尚不清楚BMP-介导的成骨生物学上的变化是否会直接影响HSPC的功能。

以前，人们发现TGF-β可以影响基质细胞系中Cxcl12的表达（26）。

这里，我们揭示了BM龛中，通过SMAD依赖性BMP信号转导途径调控CXCL12的表达，影响了HSCs的导向与移植成活，也影响造血祖细胞的动员。

MATERIAL AND METHODS此处暂略RESULTS系统性抑制SMAD-依赖性BMP信号转导途径增强了HSCs的导向与移植成活为了评估SMAD依赖性BMP信号转导途径在成年造血过程中的作用，我们对经亚致死量辐射处理过的CD45.2小鼠静注PBS/NGN。

NGN与BMPs结合，抑制其与其受体的结合（34）。

大约50000个来自CD45.1小鼠的BM细胞被移植到经处理后的CD45.2小鼠中，以评估在BMP信号转导途径发生改变后，移植成活方面是否有任何变化（Fig.1A,1B）。

我们观察到移植后第4，8及12周，在未注射NGN的原始受体内的供体源性嵌合现象连续增加。

另外，对继发受体的分析显示，注入NGN的小鼠中，长期供体源性的与BM的嵌合现象增加了3倍。

这些研究揭示了SMAD信号转导途径的抑制显著增加了HSCs的长期群体恢复（repopulation）能力。

为了确定注射了NGN的小鼠中，HSPCs的移植成活增加是否是由导向能力增强所致，所有的BM细胞或lin-细胞被注射到受到致死剂量辐射的动物中，移植后16小时，定居在BM内的克隆形成细胞（CFCs）的总数被统计出来，并与注射的CFCs的数量进行比较（Fig.1C）。

植入的CFCs在BM中定居的比例，在那些NGN处理前的动物中明显更高。

换言之，注射BMP7而不是BMP4，会引起植入HSCs的导向能力下降。

下一步我们检验了注入NGN后，在龛内表达的关键造血调控因子相应的表达情况（Supporting Information Fig.1A）。

向小鼠注入PBS/NGN后24小时，用压碎与胶原酶Ⅰ处理分离出后肢骨中的BM细胞。

用MACS分离的lin-CD45-BM龛细胞来做qRT-PCR以定量其基因表达情况。

在所有被分析的基因中（Cd44，Cxcl12，Icam1，Vcam1，Mmp7，Mmp9，Upa，Ang1，Opn，Scf，以及Ccl2），我们发现Cxcl12的表达在NGN注射后增加了2倍（Supporting Information Fig.1A）。

我们重复了这些实验，评估在注射PBS/BMP7/NGN之后，除了Cxcl12表达之外的SMAD目标基因的表达，以分析SMAD信号转导途径的状态（Fig.1D）。

SMAD目标基因Id2，Id3，以及Runx2的表达在BMP7注入后增高了，而与注射PBS的对照组相比，注射NGN后的小鼠中，这些目标基因的表达下降了，这证实了注射的蛋白质对龛细胞中SMAD依赖性BMP信号转导途径的反应性调控（Fig.1D）。

另外，注入BMP7增加了lin-CD45-BM细胞中SMAD目标基因的表达，而减少了Cxcl12的表达，这与NGN注射的结果相反。

之后我们测试了注入DM，一种特异性SMAD 磷酸化抑制剂（35），是否会产生类似NGN的效果。

我们观察到注射DM也能引起lin-CD45-BM 细胞中Cxcl12表达的增加（Supporting Information Fig.1B）。

这也伴随着移植后16小时内定居在BM中的植入CFCs比例增加（Supporting Information Fig.1C）。

我们也通过对BM血浆的ELISA评估了由BM龛细胞分泌的CXCL12蛋白（Fig.1E）。

与基因表达结果一致，NGN和BMP7也影响了BM血浆中CXCL12蛋白的水平。

我们没有发现外周血CXCL12水平有任何变化（PB; Fig.1F）。

在BM基质细胞中抑制SMAD介导的BMP信号转导途径强化了CXCL12的表达由于CXCL12是已知的最重要的将HSCs趋向到龛中的化学因子，我们研究其表达程度的改变是否会引起HSPCs向经过NGN处理的龛中迁移。

我们使用了成熟BM基质源性细胞系ST2作为离体模型，用小室转移系统（transwell system）测定迁移（Fig.2A）。

我们评估了谱系耗竭的（lineage-depleted）BM细胞（被PKH-26标记），向ST2细胞趋化迁移的过程，这种ST2细胞要么受了NGN或DM处理，要么就没受处理。

DM是一种BMP信号转导途径非常强力的小分子抑制剂，通过选择性抑制BMP受体Ⅰ来发挥作用。

用DM抑制BMP信号转导途径引起HSPCs向ST2细胞迁移（Fig.2A）。

增加NGN也使得HSPCs向ST2细胞的趋化过程增强，提示有信号途径的自分泌调节参与进来。

由于静注BMP7抑制了植入HSPCs的导向，我们也分析了HSPCs向经BMP7处理过的ST2细胞迁移的可能性。

但是，和活体中BMP7对HSPCs定居产生的作用不同，我们没有发现离体条件下BMP7对迁移有任何影响。

由于注射BMP7/NGN造成SMAD信号转导途径改变，并伴有BM龛中Cxcl12的表达变化。

我们检验了经处理的ST2中Cxcl12的表达是否也有相同的变化。

在有BMP抑制剂NGN 或DM存在的情况下培养两天，ST2细胞中，Cxcl12的表达与对照组相比，用qRT-PCR检测（Fig.2B）。

我们观察到ST2细胞中，在SMAD信号途径受到NGN或DM抑制的情况下，Cxcl12表达情况显著增高，我们测定了那些受DM或未受DM处理的ST2细胞的上清液中CXCL12蛋白的水平，进一步扩展了这些发现（Fig.2C）。

与基因表达的数据一致，我们发现经DM处理培养的ST2 细胞，与对照组相比，CXCL12的分泌水平增高。

这些结果被我们做的荧光素酶启动子试验进一步证实，在该试验中，CXCL12启动子被复制到pGL3载体的荧光素酶基因上游（the CXCL12 promoter was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL3 vector）。

ST2细胞转染了含有CXCL12启动子的载体，然后用双重荧光素酶试验来评估受对照载体处理，或受DM/NGN抑制剂处理后荧光素酶的活性（Fig.2D）。

NGN和DM都增强了CXCL12介导的荧光素酶表达，不过NGN的增强效果要弱于DM。

除了ST2细胞，我们还用原始BM基质细胞来做qRT-PCR，评估Cxcl12的表达是否受到了SMAD信号途径改变的影响（Fig.2E）。

就像对ST2细胞的影响那样，用DM或NGN抑制SMAD介导的BMP信号途径，也诱导Cxcl12在原始BM基质细胞中表达增加。

这些结果揭示了在那些属于BM龛的细胞中，抑制BMP信号途径增强了Cxcl12的表达。

此外，NGN在Cxcl12表达上的作用提示，SMAD介导的BMP 信号途径在基质细胞中确实是活化的，这或是由FBS中的BMPs存在所致，或是由这些细胞中的BMPs所致。

ST2细胞中Cxcl12的表达受到自分泌形式的调控在我们揭示ST2细胞中SMAD依赖性BMP信号途径的抑制增强了HSPCs的趋化并增加了CXCL12的产量时，通过增加BMP7进行的刺激在离体情况下却没有这些效果。