热原检查法ppt课件
热原检查法
热原检查法中国鲎成为了国家二级保护动物，鲎试剂成为了紧俏资源。
作为一个注射剂制药企业的QC，不得不考虑以后怎么来应对，除了采用减少鲎试剂的用量外，可选择重组鲎试剂或采用重组C因子法，但结果的等效性研究这个拦路虎很难打到。
百无聊赖就翻开了《中国药典检测分析指南》2017年版的热原检查法，开卷有益，该版指南对人员检查的基本原理等进行了全面的阐述，现将学习内容进行总结。
1、热原相关的定义及来源1.1 相关定义热原是注射进入人体或动物体内后，能导致其体温升高的一类物质的总称。
可以直接导致体温升高的物质称为外源性热原，由外源性热原引起体内产生的致热物质称为内源性热原。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）。
当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素。
LPS是高分子量的脂多糖。
思考：以上定义解释了注射剂为什么要进行热原检查或细菌内毒素检查。
1.2 热原的致热原理外源性物质进入人体，作用到单核细胞系统，刺激其分泌内源性致热原[主要有白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）干扰素（INF）及肿瘤坏死因子（TNF）等]；内源性致热原作用于下丘脑提问调节中枢，使体温调定点上调，造成产热增加、散热减少，导致人体发热。
思考：干扰素、抗肿瘤药物等是否会影响热原的检查？1.3 外源性热原的来源1.3.1 外源性热原中微生物来源的包括：a) 革兰氏阳性菌细菌成分（脂阿拉伯甘露聚糖、蛋白、热休克蛋白A、脂磷壁酸等）；b) 革兰氏阴性菌细菌成分（脂质A、外膜蛋白、膜孔蛋白、陪伴蛋白等）；c) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞壁成分（细胞表面蛋白、菌毛、脂肽、脂蛋白、肽聚糖、胞壁酰二肽等）；d) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞外成分（毒素、超抗原等）；e) 非细胞性微生物（活病毒、真菌、酵母、疟原虫等）。
微生物产生的致热物质中，革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素致热性最强，其次是革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌致热作用较弱，真菌、病毒致热作用更弱，因此，细菌内毒素被认为是自然界最强致热原。
热原检查法课件
选择适用的家兔3只作为一组
检 查 法
给每组家兔编号图
给设定的每组输入供试品资料
给设定的每组输入注射时间
测定其正常体温后15 min内，自 耳静脉缓缓注入规定剂量(参见表51,5-2.5-3)并温热至约38℃的供试品溶 液
用酒精棉球消毒
自耳静脉注入 供试品溶液图
然后每隔30 min按前法测其体温 1次，共测6次，以6次体温中最高的 一次减去正常体温，即为该家兔体 温的升高度数。
计算机测出家兔体温曲线升高值
家兔体温测 温装置
试验用的注射器、针头及一切和供试品接触 的器皿，应置烘箱中用250℃加热30 min
第五章 药品有害物质检查技术 第二节 药品的热原检查
《中国药典》热原检查方法是采用家
热
兔升温法进行检查。
原
本法系将一定剂量的供试品，静脉 注入家兔体内，
检
在规定时间内，
查
观察家兔体温升
的
高的情况，以判定
方
供试品中所含热原
法
的限度是否符合规 定。
挑选家兔
(健康无伤 体重1.7～3.0 Kg
家 雌兔应未孕) 兔 的 准 备
测体温
(30 mi/次，8次 38.0～39.6℃ 体温差<0.4℃)
饲养环
家兔处同一环境，实验室（图）和饲养室 （图）温差不得大于5℃，实验室温度在
境要求
17～25℃， 实验全过程中，室温变化不
热
得大于3℃，应避免噪音干扰
原
试
验
家兔体在38.0℃～39.6℃，各 兔间正常体温之差不得超过1℃。
肛温计插入深度和时间各兔相同(一 般 约 6 cm) ， 时 间 不 得 少 于 1min ， 30min 测 次 ， 一 般 测 2 次 ， 两 次 体 温 之 差 不 得 超 过 0.2℃ ， 以 此 两 次 体 温 的平均值作为该兔的正常体温。
热原试验_演示文稿共24页PPT
热原试验_演示文稿
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰 Nhomakorabea▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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热原检查法
热原检查法热原检查法是一种用于检测微生物的方法，它基于微生物在特定温度下产生的热量来进行检测。
该方法被广泛应用于食品、水质、医药等领域，具有灵敏度高、快速、可靠等优点。
下面将从原理、操作步骤、优缺点和应用等方面进行详细介绍。
一、原理热原检查法是通过测量微生物在特定温度下产生的热量来进行检测的。
该方法主要基于微生物代谢活动所产生的热量，利用热电偶或红外线传感器对微生物所产生的热量进行实时监测。
当微生物数量较多时，其代谢活动所产生的热量也会相应增加，从而能够通过仪器显示出来。
二、操作步骤1. 样品制备：将待测样品按规定方法处理后，制备成适宜的试样。
2. 检测设备准备：根据使用说明书正确安装设备，并连接好电源和计算机。
3. 仪器调试：按说明书要求对仪器进行调试，并进行空白测试和标准曲线建立。
4. 样品检测：将制备好的样品加入检测仪器中，按要求设定温度和时间，进行检测。
5. 结果分析：根据仪器显示结果进行分析判断，确定样品中微生物的种类和数量。
三、优缺点优点：1. 灵敏度高：热原检查法对微生物的检测灵敏度高，可以检测到微生物数量较少的样品。
2. 快速：该方法操作简便，可以在短时间内获得检测结果，适用于快速筛查大批量样品。
3. 可靠性强：该方法结果准确可靠，并且不受环境影响。
4. 适用范围广：热原检查法适用于多种类型的样品，包括食品、水质、医药等领域。
缺点：1. 无法区分微生物种类：热原检查法只能确定样品中是否存在微生物以及其数量，并不能区分不同种类的微生物。
2. 对温度要求高：该方法对温度要求较高，在操作过程中需要掌握好温度控制以及时间控制等参数。
3. 不适用于活菌数的计数：由于热原检查法只能检测到微生物代谢产生的热量，因此不适用于活菌数的计数。
四、应用热原检查法广泛应用于食品、水质、医药等领域。
在食品领域中，该方法可以用于检测肉制品、水产品、奶制品等样品中的微生物。
在水质领域中，该方法可以用于检测自来水、污水等样品中的微生物。
生物实验--热原检查法
生物实验--热原检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用家兔供试用的家兔应健康合格，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。
预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。
未经使用于热原检查的家兔；或供试品判定为符合规定，但组内升温达0.6℃的家兔；或3周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前3～7日内预测体温，进行挑选。
挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内，且与最低体温的相差不超过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。
用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可供第2次检查用。
如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。
每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。
试验前的准备在作热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3℃，避免噪音干扰。
家兔在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。
家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。
测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分半钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。
当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1℃。
试验用的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟，也可用其他适宜的方法除去热原。
检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度（℃）。
热原检查法(兔法)
1.目的：建立产品中热原检查的标准操作规程。
2.范围：产品的热原检查。
3.责任：质量监督部。
4.内容：本法适用于《中国药典（1995年版）》附录中“热原检查法—兔法”。
4.1实验材料及用具：4.1.1天平：精度0.01或0.1mg 供试品称量用精度0.1或1mg 试剂称量用精度10g 家兔称重用4.1.2电热干燥箱：（50-300±1）℃。
4.1.3恒温水浴：（37-100±0.5）℃。
4.1.4热原测温仪或肛门体温计，精度0.1℃。
4.1.5家兔固定盒：盒的两侧有通气孔。
4.1.6实验用具：注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、金属制密封器（均需去热原）、时钟、直镊、脱脂棉或细软卫生纸。
4.1.7试剂：75％乙醇、凡士林或50％甘油、新蒸馏水（4小时内蒸馏）、灭菌注射用水（经热原检查，3只家兔中体温升高0.4℃的最多只有1只，且3只家兔体温升高总数低于1℃，或经细菌内毒素检查，含细菌内毒素低于0.5EU／m1）、无热原氯化钠（经250℃ 30分钟或200℃ 1小时或180℃ 2小时加热除热原）。
4.2溶液配制：供试品溶液。
4.2.1原料药：4.2.1.1精密称取适量，置烧怀、三角瓶或称量瓶中。
4.2.1.2按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，搅拌使溶解。
4.2.2注射液：4.2.2.1用75％乙醇棉球消毒安瓶颈部，割开安瓶。
4.2.2.2精密量取一定量药液。
4.2.2.3按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水，混匀。
4.2.3注射用生理盐水：4.2.3.1称取无热原的氯化钠适量至烧杯或三角瓶中。
4.2.3.2加入供试品“注射用水”适量，配成0.9％的等渗溶液。
4.3实验动物：4.3.1健康无伤、体重1.7-3.0kg、同一来源、同一品系家兔，雌兔应无孕，一兔一笼，标兔号。
4.3.2新兔预选：4.3.2.1新兔经饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。
热原检查法课件
供试品溶液图
然后每隔30 min按前法测其体温 1次，共测6次，以6次体温中最高的 一次减去正常体温，即为该家兔体 温的升高度数。
计算机测出家兔体温曲线升高值
家兔体温测 温装置
试验用的注射器、针头及一切和供试品接触
的器皿，应置烘箱中用250℃加热30 min
家兔体温 检查确实
实验器具 的准备
注射器、针头等和供试品接 触的器皿， 应250℃加热30 min，或其他适宜的方法除去 热原。
选择适用的家兔3只作为一组
检 查 法
给每组家兔编号图
给设定的每组输入供试品资料
给设定的每组输入注射时间
测定其正常体温后15 min内，自 耳静脉缓缓注入规定剂量(参见表51,5-2.5-3)并温热至约38℃的供试品溶 液
测体温
(30 mi/次，8次 38.0～39.6℃ 体温差<0.4℃)
家 兔 的 准 备
饲养环 境要求
热 原 试 验 检 查 前 准 备
家兔处同一环境，实验室（图）和饲养室 （图）温差不得大于 5℃，实验室温度在 17 ～ 25℃， 实验全过程中，室温变化不 得大于3℃，应避免噪音干扰 家兔正常体温在 38.0℃～ 39.6℃，各 兔间正常体温之差不得超过1℃。 肛温计插入深度和时间各兔相同 ( 一 般 约 6 cm) ， 时 间 不 得 少 于 1min ， 30min 测次，一般测 2 次，两次体温 之差不得超过 0.2℃，以此两次体温 的平均值作为该兔的正常体温。
第五章
药品有害物质检查技术
第二节 药品的热原检查
热 原 检 查 的 方 法
《中国药典》热原检查方法是采用家 兔升温法进行检查。
本法系将一定剂量的供试品，静脉 注入家兔体内， 在规定时间内， 观察家兔体温升 高的情况，以判定 供试品中所含热原 的限度是否符合规 定。
YBB60232012热原检查法
YBB60232012热原检查法Reyuan JianchafaTests for Pyrogen本法系将供试液经静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用家兔应符合热原检查法（中国药典2010年版二部附录ⅪD）中供试用家兔的要求。
试验前的准备应符合热原检查法（中国药典2010年版二部附录ⅪD）中试验前的准备要求。
供试品溶液的制备制备过程应按无菌操作法进行。
将供试品用纯化水冲洗干净后，用滤纸吸干，切成约0.5cm×3cm条状，置浸提容器内。
除另有规定外，供试品置高压蒸汽灭菌器内，在115℃保持30分钟，再按表1规定加入浸提液，使浸提液浸没供试品，按表2条件浸提，即得。
供试液应在制备后2小时内使用。
表1 供试品表面积或重量与浸提液的比例供试品厚度（mm）表面积或重量与浸提液体积的比例≤0.5 6cm2/ml＞0.5~1.0 3cm2/ml＞1.0 1.25cm2/ml不规则形状0.2g/ml表2 浸提条件浸提温度（℃）浸提时间（小时）37±1 24±237±1 72±250±2 72±270±2 24±2检查法取适用的家兔3只，测定其正常体温符合要求后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入温热至约38℃的供试品溶液，注射剂量为10ml/kg，然后每隔30分钟按前法测量其体温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度（℃）。
如3只家兔中有1只温度升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔体温升高的总和达1.3℃或高于1.3℃，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判断在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，均判定供试品的热原检查符合规定。
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英国药典
≥1.5kg
不限，雌兔 应无孕
20-23℃
—
中国药数
8次 30min/次
选择条件
8次体温均在38.0-39.6℃之间， 且最高与最低体温相差≤0.4℃， 个体间体温差≤1℃ 体温不超过39.8℃，个体间体温 差 ≤ 1℃
美国药典
7天内
N
8次 30min/次 10次 30min/次，舍 去前2次
热原检查法的定义
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试 品中所含热原的限度是否符合规定
实验耗材去热原
试验用的注射器、针头及 一切和供试品溶液接触的耐高 温器皿,应置烘箱中用250℃加 热30分钟（英国药典200℃1h） 不耐高温器皿可置于30％ 双氧水中浸泡4h，再用细菌内 毒素检查用水充分冲洗，60℃ 烘干备用
美国药典
三只动物体温升高均 低于0.5℃
三只动物出现体温升高数高于 0.5℃
1.15℃ ＜3只体温升高总和≤2.65℃ 2.80℃ ＜ 6只体温升高总和≤4.30℃ 4.45℃ ＜ 9只体温升高总和≤5.95℃
英国药典
3只体温升高总和 ≤1.15℃
3只体温升高总和＞2.65℃
复试及结果判断:
•
中国药典
英国药典
1-3天
10ml/kg生 理盐水
（38.5℃）
体温在38.0-39.8℃之间，个体 间体温差≤1℃
注意事项
1. 抓取兔子的正确方法：一手抓持兔颈背部皮毛，一手托起兔臀部。 2. 在热原检查前1～2日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室 和饲养室的温度相差不得大于3℃，在试验全部过程中，应注意室温变化不得 大于3℃。 3. 应避免噪音干扰。 4. 整个试验操作过程应尽量轻柔，避免激惹动物，造成体温大幅波动，影响结 果。 5. 家兔在试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中,直至试验完毕。 6. 读取体温：一手拿住体温计尾部，使眼与体温计保持同一水平，然后慢慢地 转动体温计 ，从正面看到水银柱时就可读出相应的温度值 ，切记不可用手 碰触水银球端 7. 静脉给药前需将供试品温热至38℃（美国药典37±2℃，英国药典38.5℃）， 注射要缓慢。
初试
1.试验前至少1小时停止给食并置于适宜的装置中，使其适应试验环境，饲 养温度与环境温度相差≤±3℃。 2.每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次（英国药典测4次，但前2次舍 去），两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为该兔的正常 体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃的范围内，且各兔间正 常体温之差不得超过1℃。两次体温的平均值作为兔的正常体温。 2、测定 其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量（10ml/kg）并温热 至约38℃的供试品溶液. 3.每隔30min按前法测量其体温1次,共测6次。
实验步骤
另取5只动物进行 复试，试验方法同 初试
合格
复试5只动物中体温升高≥0.6℃的动物 数不超过1只，合并初试三只动物，体 温升高总和≤3.5℃
不合格
复试5只动物中体温升高＞0.6℃的动 物超过1只；或合并初始、复试8只动 物体温升高总和＞3.5℃
美国药典
另取5只动物进行 合并初试、复试8只动物，体温升高超 合并初试、复试8只动物，体温升高 复试，试验方法初 过0.5℃的动物数≤3只，或者超过3只， 超过0.5℃的动物数＞3只，体温升高 但体温升高总数≤3.3℃ 总数＞3.3℃ 试 加试3只动物，最 多加试三组，合并 初试共12只动物
热原的定义
热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化 学热原等。 这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的尸体 及其代谢产物。大多数微生物都能产生热原，致热能力最强的是 革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌 则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。它的化学结构 是脂多糖和微量蛋白的复合物
实验动物的选择
—
中国药典
体重
＞1.7kg
性别
不限，雌兔 应无孕 不限，雌兔 应无孕
条件
使用7天预养期未见异常的未试动 物，或已试的符合热原规定的动 物。 不使用3天内已试动物，不使用热 原试验不合格的动物。
饲养温度
17-25℃
试验温度
变化≤3℃
美国药典
≥2.0kg
20-23℃
选定温度 ± 3℃ 变化≤3℃
4.以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数，当动 物升温为负值时，以0℃计算。
初试结果判断:
合格
中国药典
复试
不合格
体温升高≥0.6℃的动物数 量超过1只
—
三只动物体温升高均低 三只动物出现体温升高高于0.6 ℃ ， 于0.6℃，且三只动物体 或者三只动物体温升高总和高于 温升高总和低于1.3℃ 1.3℃
热源的性质
热原除具有很强的致热性外，还具有下列性质： 耐热性：180℃2小时以上或250℃30min以上才能彻底破坏热原。因 此，玻璃制品如生产过程中所用的容器和注射时使用的注射器等，均可 用高温破坏热原。 水溶性：热原能溶于水，可用大量无热原注射用水冲洗以除去热原。 不挥发性：热原本身不挥发，但可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水中，故用 蒸馏法制备注射用水时，蒸馏水器应有隔离装置。 滤过性：热原体积极小,直径1~50nm,可通过普通滤器进入滤液中。 不耐强酸、强碱、强氧化剂：热原能被盐酸、硫酸、氢氧化钠、高锰 酸钾、重铬酸钾等所破坏。
热原的危害
热原反应：热原进入机体后的数分钟至1小时内,突然发冷、 寒战、面色苍白、四肢冰冷、烦躁不安等症状。持续时间约 0.5~1小时。寒战消失后,随即高热,但也有无寒战期而突然高 热者。病人体温迅速上升,在2~4小时体温上升至高峰,一般在 39~40℃,严重者高达41℃以上,病人面色潮红、头痛、恶心、 呕吐。严重者瞻妄、昏迷,甚至死亡。
热原与细菌内毒素的区别
热原物质包括了细菌内毒素，细菌内毒素是众多热原物质 中的一种，也是最主要的一种。 一般来说内毒素是热原,但热原不仅仅包括内毒素。不是每 一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂 多糖都有热原活性。在药品生产质量管理规范（GMP）条 件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在 细菌内毒素意味着不存在热原。