无菌检查法培训课件
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无菌检查法培训-PPT课件
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
Βιβλιοθήκη 菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保 存在2～8℃可在 24小时内使用。黑曲霉孢子 悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内 使用。 培养基接种 取每管装量为 12ml的硫乙醇酸 盐流体培养基 9支，分别接种小于100 cfu的金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌、生孢梭菌各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马 丁培养基5支,分别接种小于 100 cfu的白色念 珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养5天。逐日观察结果。 结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的 培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度 检查符合规定。
薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数量作阳性对 照用；若采用直接接种法，应增加供试品 1支（或 瓶）作阳性对照用。）
表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽 验样品的最少检验数量
无 菌 检 查 法
表3. 固体制剂最少检验量及上市抽 检样品的最少检验数
金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
无菌检查法及其验证
15－25
供试品溶液的制备
④非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或其
它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。 用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3 次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。 培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。 其他类供试品： ⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 ⑥无菌气（喷）雾剂供试品 ⑦装有药物的注射器供试品 ⑧具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品
❖ 若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品不符合规定。
❖ 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。 ❖ 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果
无效：
15－30
❖ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结 果不符合无菌检查法的要求；
❖ 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素；
❖ 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml，以避免 滤膜上的微生物受损伤。
❖ 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般薄膜 过滤器。滤膜孔径不大于0.45μm，直径约为50mm。
15－21
供试品的无菌检 查法
❖ 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数量 ❖ 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照；
❖试验同时应做空白对照
15－16
培养基说明
❖ 无菌检验培养基所能支持生长的微生物是有限的。 ❖ 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的生长要求，如：营
养、温度和氧等。 ❖ 无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，选择了支
持那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物的营养 的培养基。
供试品溶液的制备
④非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或其
它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。 用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3 次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。 培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。 其他类供试品： ⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 ⑥无菌气（喷）雾剂供试品 ⑦装有药物的注射器供试品 ⑧具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品
❖ 若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品不符合规定。
❖ 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。 ❖ 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果
无效：
15－30
❖ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结 果不符合无菌检查法的要求；
❖ 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素；
❖ 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml，以避免 滤膜上的微生物受损伤。
❖ 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般薄膜 过滤器。滤膜孔径不大于0.45μm，直径约为50mm。
15－21
供试品的无菌检 查法
❖ 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数量 ❖ 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对照；
❖试验同时应做空白对照
15－16
培养基说明
❖ 无菌检验培养基所能支持生长的微生物是有限的。 ❖ 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的生长要求，如：营
养、温度和氧等。 ❖ 无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，选择了支
持那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物的营养 的培养基。
无菌技术 ppt课件
无菌技术
1、无菌器械、用物等不可超出无菌台边缘 2、无菌台台布至少下垂30cm 3、下垂无菌台布任何人不得接触 4、无菌单被浸湿应及时加盖 5、坠落物品不得向上提拉或再用
五
取
用
无 菌
1、取下并检查器械包上的 2、用手直接打开器械包第
指示胶带及名签。
一层，先远侧后近侧。
器
械
（2） 3、器械护士穿无菌衣后双 4、器械护士将器械移置
无菌技术
1.预防手皮肤微生物再生， 避免手术区域遭到感染
2.自我防护
戴 无 菌 手 套
1、取出无菌手套。
2、手套掌心相 对，分清左右手。
3、未戴手套的手 勿触及手套外面。
（1）
4、已戴手套的手 5、将手套翻折部 6、检查手套有无 勿触及手套内面。 翻回盖住罗纹袖口。漏气及破损。
戴 无 菌 1、手不出袖口
无菌技术
1、清洁指甲、手、手臂的污物 2、清除或者杀灭手部暂居菌 3、使手指常居菌数不超过5cfu/cm2 4、抑制微生物的快速再生
无菌技术
清洗 手、手臂
首次刷洗
流水冲洗
再次刷洗
无菌技术
1、洗净双手至肘上10cm。 2、用无菌刷子取适量刷 手液（约3-5ml）。
外科手消毒步骤（2）
1、指尖
2、指蹼
（1）
4、后襟系带交给 其他手术人员或用
无菌持物钳夹住。
5、将腰带绕过 身体,注意保持衣
带无菌。
6、腰带系于腰部 前方。
无菌技术
1、无菌区域为肩以下，腰以上及双臂。 2、 穿无菌手术衣时未戴手套的手不可
拉衣袖或触及其它部位。 3、穿好无菌衣、戴无菌手套后，手臂应
保持在胸前，高不过肩，底不过腰，双 侧不过腋中线，双手不可交叉放于腋下。 4、有破口的无菌衣应更换。
微生物检验技术培训PPT课件
17
第17页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
16
第16页/共80页
二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
24
第24页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
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二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
无菌检查法
修订为：“ 液体制剂最少检验量及上市抽验 样品的最少检验数量”。——明确液体制剂 最少检验量见表2的第2列，供试品最少检验 数量见表2的第3列。 · 修订了表2下的 注: ——对供试品容器装 量不够接种两种培养基的情况，明确规定最 少检验数量应加倍。
表3
• 将表3原名称：“上市抽验样品（固体制 剂）的最少检验量”
的必检项目，为对所检供试品的质量负责， 对检验质量的负责，应对检出菌有一定的 证明。
● 理由（3） 全国微生物重点实验室的建立和发展，
以及现有微生物检定能力的证明，是药典 增加检出菌检定规定的基础建设和技术支 撑。
相信随着科技的进步、国家对药品安全的 关注，和我们对无菌检查法的深入研究及微 生物检定能力的发展，药典无菌检查法中增 加对检出菌的检定要求是必须的，也是能够 做到的！！
——美国药典中同时收载两种巯乙醇酸 盐流体培养基供选择，其中之一无刃天青 和琼脂。
引入思考：什么情况下应选择用？为甚我 国只收载一种？
理由（4） 可能存在严格厌氧菌——巯乙醇酸盐
流体培养基中所营造的厌氧环境是否足 以满足严格厌氧菌的培养需要。
引入思考：现无菌检查的实验操作、培 养条件是否满足严格厌氧菌的检出。
轮船正招式成商立局，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
2．航空
(1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始
研制 。
(2)发展水：上1飞918机年，北洋政府在交通部下设“
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
·5、增、修订：装有药物的注射器供试
品的检验方法 ——删除 “装上无菌针头（非包装中
表3
• 将表3原名称：“上市抽验样品（固体制 剂）的最少检验量”
的必检项目，为对所检供试品的质量负责， 对检验质量的负责，应对检出菌有一定的 证明。
● 理由（3） 全国微生物重点实验室的建立和发展，
以及现有微生物检定能力的证明，是药典 增加检出菌检定规定的基础建设和技术支 撑。
相信随着科技的进步、国家对药品安全的 关注，和我们对无菌检查法的深入研究及微 生物检定能力的发展，药典无菌检查法中增 加对检出菌的检定要求是必须的，也是能够 做到的！！
——美国药典中同时收载两种巯乙醇酸 盐流体培养基供选择，其中之一无刃天青 和琼脂。
引入思考：什么情况下应选择用？为甚我 国只收载一种？
理由（4） 可能存在严格厌氧菌——巯乙醇酸盐
流体培养基中所营造的厌氧环境是否足 以满足严格厌氧菌的培养需要。
引入思考：现无菌检查的实验操作、培 养条件是否满足严格厌氧菌的检出。
轮船正招式成商立局，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
2．航空
(1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始
研制 。
(2)发展水：上1飞918机年，北洋政府在交通部下设“
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
·5、增、修订：装有药物的注射器供试
品的检验方法 ——删除 “装上无菌针头（非包装中
无菌检查法
无菌检查法1.目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。
2.范围：对成品的无菌检查。
3.责任：质量监督部。
4.内容：4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种方法。
无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。
4.2仪器、设备和用具：℃及除湿装置。
缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。
℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。
℃的生化培养箱。
4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。
℃灭菌30分钟。
4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。
±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。
适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。
4.3试液：4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。
4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。
4.3.3灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。
4.3.4新洁尔尔灭（1:1000）溶液。
4.3.53-5％甲酚溶液。
4.3.60.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。
无菌检查法课件
微生物的检测方法
01
02
03
04
培养法
通过培养基培养微生物，观察 其生长情况，进行检测。
显微镜检查
通过显微镜观察微生物的形态 、大小、染色等情况，进行检
测。
生物发光检测法
利用生物发光原理，检测微生 物的存在。
免疫学方法
利用抗原抗体反应，检测微生 物的存在。
03
无菌检查法的操作流程
样品采集
采样前准备
霉菌
常见的无菌检查对象，包 括酵母菌、霉菌等。
病毒
体积较小的微生物，需要 特殊的方法进行检测。
微生物的生长条件
营养物质
微生物生长需要各种营养 物质，如碳源、氮源、水 、无机盐等。
温度
不同微生物需要在不同的 温度下生长，一般温度范 围在20℃-45℃之间。
pH值
微生物生长的酸碱度条件 ，不同微生物适应的pH值 范围不同。
操作规范
严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
样本处理
对样本进行适当的处理，以去除杂菌并保留所需检测的微生物。
培养条件
确保培养基处于适宜的温度和湿度条件下，以促进微生物的生长。
观察记录
对实验过程进行详细记录，包括操作步骤、观察结果等。
实验后的处理
器具清洗
实验结束后，对使用过的器具进行彻底清洗 和消毒。
防止污染
在接种和培养过程中，应采取措施防 止培养基和培养物受到污染。
结果观察与判定
观察微生物生长情况
定期观察培养物的生长情况，记录生 长特征和菌落形态等信息。
菌落计数
结果判定
根据检验目的和标准要求，对观察到 的微生物生长情况进行判定，如是否 符合无菌要求或特定微生物的存在与 否。
无菌检查法PPT
培养基与试验菌
培养基种类及用途
维扬我武 克壮其猷 第5页
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 硫乙醇酸盐流体培养基 营养琼脂培养基 营养肉汤培养基
稀释液和冲洗液
菌液制备中用于生孢梭菌的液体培养；无菌检查方法学验证中 用于滤筒中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的 培养。
用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的 活化培养与平板计数。
无菌方法学验证
维扬我武 克壮其猷
薄膜过滤法
第19页
为降低在洁净区操作菌液风险，也可在保证滤膜 完整性的前提下，将装有培养基的滤筒移至阳性 室，然后使用注射器吸取1ml合适浓度（<100 cfu）的菌液注入供试品及阳性对照滤筒内。
阳性对照 取一装有同体积培养基的集菌培养器，加入等量试验菌，做为阳性对照。 阴性对照 取相同稀释液、冲洗液及同批次集菌培养器同法操作，做为阴性对照。
——中国药典第三部附录XII A 《无菌检查法》
定义与要求
标准依据 《中国药典》2010年版： 一部 附录XIII B 二部 附录XI H 三部 附录XII A
标准依据、人员要求
维扬我武 克壮其猷 第3页
人员要求
无菌检查人员需要具备微生 物专业知识，并经过无菌技 术培训。
定义与要求
环境要求
维扬我武 克壮其猷 第4页
如含供试品的任意容器内试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验 量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基用量、使用灭活剂 和中和剂、更换滤膜品种等方法消除抑菌作用，并重新进行方法学验证。如使用中 和剂、灭活剂和表面活性剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
无菌方法学验证
图片来自网络
无菌方法学验证 薄膜过滤法-操作