白术药材HPLC色谱指纹图谱研究

白术药材HPLC色谱指纹图谱研究于　超1,阳　勇3,刘世尧2,白志川2,张小梅3,王婷婷3Ξ(11重庆医科大学,重庆　400016;21西南农业大学,重庆　400716;31重庆市中药研究院,重庆　400065)摘　要:目的　应用H PL C法建立酉阳规范化种植白术的指纹图谱,为白术药材的质控提供依据。

方法　采用Symm etry C18色谱柱(250mm×4.6mm,5Λm);以甲醇2水(65%～100%)连续梯度洗脱,体积流量018mL m in;在254nm波长下检测。

测定11批药材的色谱图,确立标准指纹图谱。

结果　白术药材有11个共有峰,多数峰可以达到较好分离。

该分析方法具有很好的精密度、重现性和稳定性,各批次间共有峰的相对保留时间的R SD均小于1%,相对峰面积符合指纹图谱相关要求。

结论　建立的指纹图谱检测标准可以作为白术质量评价和品种鉴别的主要依据之一。

关键词:白术;高效液相色谱;指纹图谱中图分类号:R28217 文献标识码:A 文章编号:02532670(2006)05076604F i ngerpr i n t of R h izo m a A tracty lod is M acrocep ha lae by HPLCYU Chao1,YAN G Yong3,L I U Sh i2yao2,BA I Zh i2chuan2,ZHAN G X iao2m ei3,W AN G T ing2ting3 (11Chongqing U niversity of M edical Sciences,Chongqing400016,Ch ina;2.South2W est A griculture U niversity, Chongqing400716,Ch ina;3.Chongqing A cadem y of Ch inese M ateria M edica,Chongqing400065,Ch ina) Abstract:Objective　To estab lish the ch rom atograph ic fingerp rin t of R h iz o m a A tracty lod is M acro2 cep ha lae(RAM)from GA P base at Youyang by H PL C fo r the quality con tro l.M ethods　W ith Symm etry C18co lunm(250mm×4.6mm,5Λm),gradien t elu ti on w as perfo r m ed by m ob ile p hase con tain ing M eOH2 H2O(65%—100%).T he flow rate w as0.8mL m in and detecti on w avelength w as254nm.E leven batch2 es of RAM from vari ou s p roducing areas w ere com paratively analyzed to estab lish a fingerp rin t.Results E leven M u tual p eak s w ere selected in ch rom atography.Am ong the ob tained fingerp rin t,the m o st of the detected peak s w ere sep arated effectively.T he accu racy,repeatab ility,and stab ility of th is m ethod w ere satisfied.T he R SD of relative reten ti on ti m e of m u tual p eak s w h ich ex isted in all sam p les w as less than 1%.T he resu lts of peak area w ere in acco rdance w ith the request of fingerp rin t.Conclusion　T he esta2 b lished fingerp rin t can be u sed fo r the quality con tro l and sp ecies iden tifying of RAM.Key words:R h iz o m a A tracty lod is M acrocep ha lae(RAM);H PL C;fingerp rin t 白术A tracty lod es m acrocep ha la Ko idz.原名“术”,又名贡术,菊科多年生草本,始载于《神农本草经》,列为上品,为常用大宗中药材品种,以根茎供药用,能健脾燥湿,治脾虚食少、腹泻、水肿、胎动不安。

最新的临床研究表明,白术具明显的抗衰老作用,其应用前景十分广阔[1]。

野白术产于浙江於潜、昌化、天目山一带,以於潜所产品质最佳,称为“於术”。

现白术多为栽培,已少有野生,主产浙江、安徽、湖南、湖北、江西、福建、重庆等地。

重庆产白术主要引种于浙江。

白术的主要成分为白术内酯 、 、 、 及杜松酯、棕榈酸、Β2香树素醋酸酯、Χ2谷甾醇、Β2谷甾醇及含有较高的挥发油成分。

白术有效成分的量因产地、采收季节、储藏、炮制方法、提取工艺等条件不同,会发生变化。

为了能够有效控制药材质量,根据其所含化学成分的特性和指纹图谱研究方法[2,3],通过方法考察,建立白术药材特征性色谱指纹谱图,为白术建立稳定、可靠、全面的质量控制方法提供科学依据。

1　仪器与试药111　仪器与试剂:W A T ER S600E—996高效液相色谱仪(996PDA检测器,7225i手动进样器,柱温箱,M illenn ium32化学工作站);AW220(岛津)万分之一电子天平;H66005超声清洗机;电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂);M in i Q p lu s超纯水仪(密里博)。

甲醇(色谱醇,默克公司),氯仿(上海化学试剂总厂),石油醚、丙酮(重庆市东方试剂厂),Ξ收稿日期:2005207231基金项目:重庆市自然科学基金资助项目(7351)作者简介:于　超(1963—),男,博士,从事中药化学研究。

T el:(023)68485915　E2m ail:yuchao@乙醚(上海马陆制药厂),均为分析醇。

112　药材:白术药材来源于重庆市酉阳县GA P规范化种植基地,为《中国药典》品种菊科植物白术A tracty lod es m acrocep ha la Ko idz.的干燥根茎(由赵素云研究员鉴定)。

样品编号S1～S11。

2　方法与结果211　色谱条件:Symm etry C18色谱柱(250mm×4.6mm,5Λm);柱温28℃;甲醇2水(65%～100%)为流动相,连续梯度洗脱;体积流量018 mL m in,检测波长254nm;进样量10ΛL。

212　供试品溶液的制备:取供试品粉碎,过30目筛,精密称取白术样品细粉约110g,置于三角瓶中,加入石油醚20mL超声处理20m in,滤过,残渣用甲醇洗涤3次,每次加5mL,合并滤液和洗涤液,减压浓缩至干,用甲醇溶解,置5mL量瓶中至刻度,取上清液用微孔滤膜(0145Λm)滤过,滤液置棕色量瓶中,即得。

213　H PL C分析:取样品溶液10ΛL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图(图1)和各色谱峰的保留时间,以面积归一化法计算各色谱峰的相对峰面积(A R),各谱图中峰面积最大的11个峰为11强峰。

214　方法学考察21411　精密度试验:按样品制备方法,随机抽取同一批白术药材制备供试液,连续进样5次,测定H PL C色谱图,选择11个共有峰进行比较,结果表明各共有峰相对保留时间R SD为0118%～1185%,各共有峰相对峰面积的R SD为0133%～215%,表明仪器精密度良好。

21412　重现性试验:随机取同一批白术药材,按样品制备方法平行操作,制备5份白术药材供试品溶液,测定其H PL C色谱图。

结果各共有峰相对保留时间R SD<1%,各共有峰相对峰面积R SD为211%～319%。

21413　稳定性试验:取同一批白术药材的供试品溶液,分别于0、2、4、8h测定H PL C色谱图,对11个共有色谱峰进行比较。

结果各共有峰相对保留时间R SD<1%,各共有峰的相对峰面积R SD为111%～412%,表明样品在8h内稳定性良好。

215　色谱指纹谱的构建21511　相对保留时间Α的计算:选择一个出峰时间较居中、在各样品中均存在的组分作为参照峰(Α= 1)。

求出样品所有峰的相对保留时间为:t R i t RΑ,式中t R i为各组分的出峰时间,t RΑ为参照峰的出峰时间。

21512　参照峰的选择:通过色谱图比较,可知各样品色谱图中2、3、4号峰为强信号峰,选取色谱图中的第3个强峰(4号峰)为参照峰,计算各峰的相对保留时间Α。

21513　Α值窗口的设定:计算各样品色谱图中同一峰位值的Α平均值,作为每个色谱峰的标准Α值。

计算每个峰位Α值的R SD值,所有Α值的R SD均小于1%。

所以设定窗口Α≤1,同一窗口内的色谱峰认定为同一Α值的色谱峰,予以归并,可信限范围在±1%。

按国家食品药品监督管理局“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”,研究测定了11批白术药材的色谱图谱,并制定了以内参比峰为参照物的标准指纹图谱,见图1,11批药材指纹图谱的相似性见图2。

图1　白术药材标准色谱指纹图谱F ig.1　F i ngerpr i nt peak of RA M图2　11批白术药材色谱图F ig.2　F i ngerpr i n t peak of11batches of RA M 21514　共有峰的标定:记录75m in的色谱图,通过比较各峰的保留时间选择每一个图谱都产生的共有峰。

采用相对保留时间标定共有指纹峰,以图谱中保留时间为(28±0114)m in(4号峰)的峰为参照物(s),将各指纹峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较,其比值为各指纹峰的相对保留时间。

计算11批药材指纹图谱中各指纹峰的相对保留时间(表1),标定白术药材的共有峰为11个。

11批药材中各共有峰的Α值的R SD均<1%。

21515　共有峰的相对面积:据“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”规定,各共有指纹峰的面积比值必须相对固定:单峰面积占总峰面积≥20%,其差值<20%;单峰面积占总峰面积≥10%而<20%,其差值<25%;单峰面积占总峰面积<10%,面积比值不作要求,仅需检定相对保留时间。