结肠癌干细胞与临床病理因素及survivin_表达的相关分析

ｄｏｉ：１０．３９７１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－８５７８．２０１２．０８．０１７收稿日期：２０１２－０１－０３；修回日期：２０１２－０５－０４作者单位：２０１６００上海，上海市松江区中心医院血液肿瘤科作者简介：柯金（１９７７－），男，硕士，主治医师，主要从事肿瘤内科学研究结肠癌干细胞与临床病理因素及ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｋｉ６７表达的相关分析柯　金，胡喜梅，周水阳，包维莺，范燕琴，陆　翠，戴永援，朱锐锋，王恒石，刘　媛Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　Ｆａｃｔｏｒｓ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉ６７ｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ＣａｒｃｉｎｏｍａＫｅ　Ｊｉｎ，Ｈｕ　Ｘｉｍｅｉ，Ｚｈｏｕ　Ｓｈｕｉｙａｎｇ，Ｂａｏ　Ｗｅｉｙｉｎｇ，Ｆａｎ　Ｙａｎｑｉｎ，Ｌｕ　Ｃｕｉ，Ｄａｉ　Ｙｏｎｇｙｕａｎ，Ｚｈｕ　Ｒｕｉｆｅｎｇ，ＷａｎｇＨｅｎｇｓｈｉ，Ｌｉｕ　ＹｕａｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１６００，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒ　ＣＤ１３３　ａｎｄ　ｔｏ　ｅｌｕｃｉｄａｔｅ　ｉｔｓ　ｒｅｌａ－ｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉ６７　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＤ１３３，ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉ６７　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ６０　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｃｏｌｏ－ｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｐａｒａ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｉｎｄｉ－ｃａｔｏｒｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅｓｅ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｇｅｎ－ｄｅｒ，ａｇｅ，ｓｉｔｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｍａｓｓ，ｔｕｍｏｒ　ｓｉｚｅ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｇｒａｄｅ，ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｄｅｐｔｈ　ａｎｄｐＴＮＭ　ｓｔａｇｅ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＣＤ１３３　ｗａｓ　５０％ｉｎ　ｔｈｅ　６０　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｐａｒａ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１３３　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｐＴＮＭ　ｓｔａｇｅｓ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｇｒａｄｅｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ（Ｐ＜０．０５），ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｃｌｉｎｉｃｏ－ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｗａｓ　ｏｎｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｇｒａｄｅｓ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ（Ｐ＜０．０５）．Ｎｏ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｋｉ６７　ａｎｄ　ａｎｙ　ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１３３　ｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉ６７（Ｐ＜０．０５　ａｎｄ　Ｐ＜０．０１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｒｖｉｖｉｎ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｋｉ６７（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＣＤ１３３＋ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｉｓｔ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｒ－ｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｉｓ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒ　ＣＤ１３３　ｍａｙ　ｂｅｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ；ＣＤ１３３；Ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ摘　要：目的　探讨肿瘤干细胞标志物ＣＤ１３３在结直肠癌组织中的表达，及其与临床病理因素、ｓｕｒｖｉｖｉｎ和Ｋｉ６７的关系。

方法　应用免疫组织化学方法检测６０例手术切除的结直肠癌和３０例癌旁组织及１２例正常组织中ＣＤ１３３的表达、癌组织中ｓｕｒｖｉｖｉｎ和Ｋｉ６７的表达，对各指标之间的相关关系及其与性别、年龄、肿瘤的部位和大小、病理分级、侵袭深度、淋巴结转移、ｐＴＮＭ分期之间的关系进行分析。

结果结直肠癌组织中ＣＤ１３３阳性表达率为５０％（３０／６０），显著高于癌旁及正常组织（Ｐ＜０．０１）；ＣＤ１３３的表达与淋巴结转移和ｐＴＮＭ分期密切相关（Ｐ＜０．０１），与病理分级存在相关性（Ｐ＜０．０５），与其他临床病理因素均无关；ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达仅与肿瘤的病理分级相关（Ｐ＜０．０５），Ｋｉ６７与各项临床病理参数均无相关性；ＣＤ１３３与ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｋｉ６７的表达呈正相关（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）；ｓｕｒｖｉｖｉｎ与Ｋｉ６７的表达呈正相关（Ｐ＜０．０１）。

结论　结直肠癌组织中存在ＣＤ１３３＋肿瘤细胞，肿瘤干细胞在结直肠癌的发生、发展中起重要作用，检测肿瘤干细胞标志物ＣＤ１３３的表达可作为一种判断肿瘤的恶性程度和预后的重要指标。

关键词：结直肠癌；ＣＤ１３３；肿瘤干细胞中图分类号：Ｒ７３５．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８５７８（２０１２）０８－０９５０－０４０　引言结肠癌主要的治疗手段包括手术、化疗、分子靶向治疗等，肿瘤经过根治性切除术和辅助化疗后仍有３０％～５０％左右的患者在２～３年内复发［１］。

最近研究发现，肿瘤中存在具有自我更新特性的细胞亚群即肿瘤干细胞（ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＣＳＣｓ），是引发肿瘤并维持其生长的根源，并在肿瘤的复发、转移中起着决定性作用［２－５］。

本研究通过免疫组织化学法检测结直肠癌组织中肿瘤干细胞标志物ＣＤ１３３和ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｋｉ６７的表达，以探讨肿瘤干细胞与临床病理因素、ｓｕｒｖｉｖｉｎ和Ｋｉ６７的关系。

１　材料和方法１．１　临床资料收集２０１０年６月—２０１１年６月上海市松江区·０５９·肿瘤防治研究２０１２年第３９卷第８期中心医院和上海市松江区方塔中医院结直肠癌患者根治术后石蜡包埋组织标本６０例及其临床病理资料。

其中，男性２６例、女性３４例；年龄＜６５岁者２８例、≥６５岁者３２例；平均年龄６４岁；其中结肠癌３４例、直肠癌２６例；高分化腺癌１０例、中分化腺癌４３例、低分化腺癌７例；按ｐＴＮＭ分期：Ⅰ期１１例、Ⅱ期２０例、Ⅲ期２６例、Ⅳ期３例。

患者术前均未行放化疗。

另外取３０例癌旁组织（距离肿瘤边缘＞２ｃｍ）和正常结直肠组织１２例（取自上海市松江区中心医院消化内镜室结肠镜下非结直肠癌患者）。

１．２　主要试剂兔抗人ＣＤ１３３多克隆抗体购自Ａｂｃａｍ公司，鼠抗人Ｋｉ６７单克隆抗体、兔抗人ｓｕｒｖｉｖｉｎ单克隆抗体、ＤＡＢ显色剂、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

１．３　免疫组织化学法采用Ｅｎｖｉｓｉｏｎ两步法检测标本中ＣＤ１３３、Ｋｉ６７和ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达。

操作步骤：石蜡包埋标本制成４～５μｍ厚切片；脱蜡、梯度水化；切片置于ｐＨ６．０柠檬酸缓冲液中进行煮沸处理１０　ｍｉｎ，室温冷却，ＰＢＳ漂洗；分别滴加一抗ＣＤ１３３多克隆抗体、Ｋｉ６７单克隆抗体、ｓｕｒｖｉｖｉｎ单克隆抗体，３７℃孵育１　ｈ，ＰＢＳ冲洗；加适当比例稀释的二抗，３７℃孵育２０～３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗；ＤＡＢ显色；苏木精对比染色，酒精梯度脱水，干燥，中性树胶封片；显微镜观察。

用ＰＢＳ替代一抗作为空白对照。

１．４　免疫组织化学结果判定每张切片随机取５个高倍视野（×４００），分别计数１００个细胞中阳性细胞数，取其平均值定义为该细胞的阳性细胞百分比。

由于ＣＤ１３３阳性细胞数量较少，先在低倍光学显微镜下（×１００）寻找细胞阳性区域，然后在高倍镜下计数ＣＤ１３３阳性细胞个数，其中无阳性细胞表达者定义为阴性（－），有阳性细胞表达者定义为阳性（＋）。

ＣＤ１３３为跨膜蛋白，定位于细胞膜及细胞质。

ｓｕｒｖｉｖｉｎ定位于细胞质或细胞核，Ｋｉ６７定位于细胞核，以出现棕黄色高出背景色为阳性细胞。

ｓｕｒｖｉｖｉｎ阴性（－），阳性细胞数＜１０％；ｓｕｒｖｉｖｉｎ阳性（＋），阳性细胞数≥１０％。

Ｋｉ６７标记指数（Ｋｉ６７　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｉｎｄｅｘ，Ｋｉ６７　ＬＩ）以阳性细胞百分率表示。

１．５　统计学方法采用ＳＰＳＳ１６．０统计软件，ＣＤ１３３在不同组织中表达的差异及其与临床病理参数、ｓｕｒｖｉｖｉｎ和Ｋｉ６７的相关性分析均采用χ２检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果２．１　ＣＤ１３３＋肿瘤细胞在结直肠癌组织、癌旁及正常组织中的表达ＣＤ１３３抗原主要定位于肿瘤细胞的腺腔面细胞膜，形成膜染色的环状结构，见图１Ｂ；少数可见单个肿瘤细胞胞质染色，见图１Ｃ。

ＣＤ１３３＋肿瘤细胞在结直肠癌中呈非均匀分布，通常聚集在一个或相邻的几个癌巢中，且仅仅限于与腺腔直接接触的肿瘤细胞。

在ＣＤ１３３＋腺腔中的脱落细胞碎片，通常呈现ＣＤ１３３阳性表达，见图１Ｄ。

６０例结直肠癌标本中３０例（５０％）ＣＤ１３３阳性表达，３０例癌旁组织中１０例（３３．３％）ＣＤ１３３阳性表达，１２例正常组织ＣＤ１３３表达均为阴性。