小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较

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小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较作者：张雨欣高秋逄洪波赵佳欣秦源源姚丽梅魏继莹来源：《江苏农业科学》2015年第10期摘要：为了得到经济、简便、易于操作且效果好的基因组DNA，选取小白鼠6种不同的组织部位：肝、脾、肾、尾、肺和心脏，分别采用SDS法和CTAB法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和PCR3种手段对其质量和浓度进行检测，结果显示：小白鼠6种组织部位采用SDS和CTAB法提取的基因组DNA均可扩增得到目的基因，满足下一步分子生物学试验的要求。

但是从DNA的质量和产量方面，不同组织部位之间具有很大差别，CTAB法和SDS法针对不同的组织部位具有不同的优势。

总体来看，在小鼠的6种组织部位中，肝脏最适合用来提取基因组DNA。

关键词：SDS法；CTAB法；基因组DNA；DNA提取；小白鼠；组织器官中图分类号： Q523 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0047-03DNA是生物体的基本遗传物质。

基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作[1]，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。

因此，学习、掌握DNA提取方法并对其进行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。

国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法[2-7]，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法进行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法[8-15]。

目前，传统的SDS法和CTAB法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。

随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多[16-19]。

基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

化、连续密度梯度离心、择性贴壁三步法分离Ｋ并比较链霉蛋白酶、不选Ｃ， Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和 Ⅳ 型胶原酶等３不同酶消化分离方法所得ＫＣ得率及纯度。结果３种不同酶消化分离方法细胞得率分别为（．２种６３
龄，洁级，四Ｊ大学华西医学中心试验动物中清由Ｉｌ心提供（可证号：４）许０６。试验前禁食１，２ｈ自由饮
水，随机分为３组。
配制，．２ｍ滤器过滤除菌，０２临用前加入ｌ新Ｏ，９６鲜灭活的小牛血清，霉素１０Ｕ／青０ｍＬ，霉素１０链０
２ｍＬ；
１１４ＳＳ液的配制１０／ｅｃｌ液和８５．．Ｐ０Ｐｒｏｌ９６．％
ＮＳ以９：１的比例混合，制成ＳＳ原液；７配Ｐ以０Ｐｒｏｌ２ｍＬ配制：Ｐ．ｅｃｌ液ＳＳ１４ｍＬ和ＰＳ０６ｍＬＢ．
２ｍＬ。酶消化液：００Ｉ型胶原酶２ｍＬ方法含．５Ｖ；
免疫调节作用，时影响肝细胞、脂细胞及内皮同贮细胞的生物学功能［。近期发现ＫＣ能诱导同种异１］
体Ｔ淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥
士０５ × １ｇ。（．６０４ ×１－，１．士０７ ×１＿；胞纯度分别为（３２１７％，９．士１５，．）０－．３６ ± ．）０ｇ。（０３．）０ｇ。细９．士．）（０７．）

小鼠淋巴细胞分离

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

小鼠淋巴细胞的分离培养

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

淋巴细胞分离方法

淋巴细胞分离方法淋巴细胞是免疫系统中的一类重要细胞，它们在保护机体免受病原体和其他外部侵袭物的侵害中起着重要作用。

为了研究和理解淋巴细胞的功能和特性，需要从体内样本中分离出淋巴细胞。

本文将介绍几种分离淋巴细胞的常用方法。

1. 密度梯度离心法密度梯度离心法是最常用的分离淋巴细胞的方法之一。

该方法基于淋巴细胞与其他细胞（如红细胞和中性粒细胞）在离心过程中在不同密度梯度下沉降速度的不同。

一种常用的密度梯度离心介质是Ficoll-Hypaque，它是一种高渗透压溶液。

将全血或其他样本与Ficoll-Hypaque混合后离心，淋巴细胞会沉积在密度梯度下层，其他细胞则沉积在上层或底层。

通过取得下层液体，可分离得到富含淋巴细胞的悬浮液。

2. 黏附法黏附法是一种常用的非离心方法。

它基于淋巴细胞与塑料或玻璃表面的亲和性差异。

将样本与普通培养皿等容器接触，淋巴细胞会黏附在容器表面，而其他细胞则较少或不黏附。

在培养过程中，淋巴细胞会逐渐扩增，并可以通过洗涤等步骤分离得到。

3. 磁珠法磁珠法是一种利用磁性特性分离淋巴细胞的方法。

通过将淋巴细胞表面标记上磁珠特异抗体，使其与抗体携带的磁珠结合，然后通过磁场使磁珠和与其结合的淋巴细胞沉降在一侧，从而分离出淋巴细胞。

这种方法可以非常精确地分离出特定类型的淋巴细胞。

4. 细胞排序法细胞排序法是一种高级的分离淋巴细胞的方法，它基于流式细胞术或荧光激光共聚焦显微镜等技术。

这种方法通过在淋巴细胞表面标记上荧光染料或抗体，然后使用器械和设备进行精确的细胞分选。

这种方法可以快速准确地分离出不同类型的淋巴细胞，并可以进一步进行功能和表型分析。

尽管以上方法在分离淋巴细胞中非常有效，但每种方法都有其局限性。

例如，密度梯度离心法在操作过程中可能会对淋巴细胞产生一定的损伤；黏附法可能对特定类型的淋巴细胞选择性较差；磁珠法和细胞排序法则需要较为复杂的设备和技术。

因此，在具体选择方法时需要综合考虑研究的目的、操作难度和资源条件等因素。

淋巴细胞分离的实验方法

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用与制作流程

图片简介:本技术提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。

小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。

该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。

技术要求1.一种小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；所述原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；所述第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；所述第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；所述第三灌流，用第三灌流液进一步消化。

2.按照权利要求1所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述原位灌流的灌流血管为肝门静脉。

三灌流液对小鼠肝脏进行灌流以后，还包括用PBS对小鼠肝脏进行灌流清洗的步骤；优选地，所述PBS的温度为36-37℃；优选地，所述小鼠原代肝细胞的分离方法还包括在第二灌流以后用37℃的PBS预热小鼠肝脏的步骤；优选地，所述第三灌流液为IV型胶原酶溶液，温度为37℃，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.03-0.05％；优选地，所述IV型胶原酶溶液的浓度为0.048％；优选地，所述第一灌流液、第二灌流液和第三灌流液分别灌流150-200mL。

4.按照权利要求1-3任一项所述的小鼠原代肝细胞的分离方法，其特征在于，所述肝周管结扎，结扎的肝周管包括：胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎依次结扎胆总管、胃十二指肠动脉、脾动脉、胃左动脉和后腔动脉；优选地，所述肝周管结扎包括如下步骤：(1)结剪断十二指肠韧带；(2)结扎胆总管；(3)结扎胃十二指肠动脉，追踪肝总动脉血液流经方向，直到暴露脾动脉与胃左动脉；(4)结扎并剪断脾动脉与胃左动脉，暴露腹腔动脉干；(5)将肝脏下翻，暴露背侧肝脏与膈肌，分离肝脏镰状韧带与左右三角韧带；(6)结扎胃左静脉，并在胰腺颈部双重结扎，并在结扎之间剪断胰腺(7)结扎后腔静脉；(8)上翻肝脏，分离肝门静脉周围淋巴组织，暴露肝门静脉，然后注射肝素100U。

小鼠肝脏淋巴细胞分离

肝脏淋巴细胞分离protocol
1. 腹腔注射100uL/只小鼠麻醉;
2. 用约20mL PBS从下腔静脉处灌洗(肾,肺,肝均变白,肝脏灌注也可);
3. 取10cm细胞培养皿,加入10mL 10% FBS+DMEM,将滤网浸于其中,取出的肝组织置于滤网中;
4. 用1mL注射器的内芯研磨,制备细胞悬液;
5. 从皿中吸取细胞悬液到50mL离心管,补加PBS至30mL;
6. 50g离心3min,上清转移至新管;
7. 1500rpm X 5min离心,2.5mL DMEM重悬细胞。

8. 准备percoll:
6mL 100% percoll + 660uL 10X PBS配成90% percoll
4mL 90% percol + 1.12mL DMEM配成70% percoll
2.5mL细胞重悬液+ 2mL 90% percoll配成40% percoll;
9. 将40% percoll细胞悬液沿管壁缓缓加入70% percoll中;
10. 2000rpm离心20min,brake和accelerate都设为level 1;
11. 吸取中间层细胞,PBS补加到10mL,400g离心10分钟;
12. 弃上清,加1mL红细胞裂解液,裂解2min
13. 补加PBS到10mL,终止裂解,400g离心10分钟
14. 将细胞重悬到合适体积,计数,用于下游分析。

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ＫＯＮＧＸｉａｏ — ｍｉｎｇ，ＪＩＮＱｉ — ｌｉ，ＷＥＩＬｉ，ＷＡＮＧＴｉｎｇ，ＦＡＮＷｅｉ，ＺＨＵＸｉａｎｇ，ＬＩＵＹｏｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ＡｎｈｕｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆＩｏｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，ＢｅｎｇｂｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＢｅｎｇｂｕＡｎｈｕｉ２３３０３０，Ｃｈｉｎａ）
１０５２
ＪＢｅｎｇｂｕＭｅｄＣｏｉｌ，Ａｕｇｕｓｔ２０１３，Ｖｏ１．３８，Ｎｏ．８
・
［文章编号］１０００ — ２２００（２０１３）０８ — １０５２－０４
技术与方法・
小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较
孔晓明。金齐力，韦莉，王婷。范伟，朱翔，刘勇
［摘要］目的：通过比较几种肝脏淋巴细胞分离方法得到的总淋巴细胞、Ｔ细胞、自然杀伤Ｔ细胞（ＮＫＴｃｅｉｌｓ）及自然杀伤细胞（ＮＫ细胞）的比例和细胞绝对数，明确各种方法的适用范围。方法：按照析因设计，将不放血（Ａ法）、摘眼球放血（Ｂ法）、体循环灌流（Ｃ法）、摘眼球结合体循环灌流（Ｂ法＋Ｃ法）４种肝脏预处理方法和单浓度离心法（Ｉ法）、非连续密度梯度离心法（ Ⅱ 法）２种Ｐｅｒｃｏ１分离方法进行全面组合，ｌ共获得８种组合条件，分离小鼠肝脏淋巴细胞，用流式细胞术检测各类型细胞比例。
结果：肝脏预处理方法中Ｂ法＋Ｃ法获得淋巴细胞比例最高，Ａ法获得淋巴细胞绝对数最高，Ｂ法获得的ＮＫＴ细胞和ＮＫ细胞
比例和细胞绝对数均最高；ＩＩ法获得的淋巴细胞、Ｔ细胞、ＮＫＴ细胞和ＮＫ细胞比例和细胞绝对数均高于Ｉ法。对于ＮＫＴ细胞比例和ＮＫ细胞绝对数，肝脏预处理方法和Ｐｅｒｃｏｌｌ浓度之间有交互作用（Ｐ＜０．Ｏ１和Ｐ＜０．０５），其他均无交互作用（Ｐ＞０．０５）。结论：采用摘眼球放血结合体循环灌流法，结合Ｐｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度法（３３％＋７０％），可获得较高数量和比例的固有
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｃｏｍｐａｒｅａｎｄｄｅｉｆｎｅｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｈｅｐａｔｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌｓ（ＮＫＴｃｅｌｌｓ）ａｎｄｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ（ＮＫｃｅｌｌｓ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｆａｃｔｏｒｉｌａｄｅｓｉｇｎ，ｆｏｕｒｌｉｖｅｒｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
免疫细胞，有助于对肝脏固有免疫细胞如ＮＫＴ细胞、ＮＫ细胞等的研究。
［关键词］细胞分离；肝脏淋巴细胞；分离方法；Ｐｅｒｃｏｌｌ；析因分析
［ห้องสมุดไป่ตู้中国图书资料分类法分类号］Ｒ４４６．１１３［文献标志码］Ａ
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｈｅｐａｔｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ