基因工程工具酶
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基因工程常用的工具酶
Py dCMP、dTMP Pu dAMP、dGMP
2024/10/14
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6
识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
2024/10/14
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14
第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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15
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
.
4
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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15
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
第二节 基因工程工具酶
第二节 基因工程工具酶【掌握常用工具酶的定义、特点、作用方式】我们大家都知道，基因工程是现代生物技术的核心技术，带动其他技术的发展。
基因工程的基本技术就是：切接 转 增 检用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。
在进行这些操作时，需要借助一类特殊的工具【如同做外科手术需要手术刀这种工具一样】，在基因工程操作中这种必不可少的工具就是——酶；由于这些酶类被用作工具，所以称之为“工具酶”。
这些酶种类繁多，作用、特点各异，到目前为止，常用的工具酶有300多种。
下面着重讲解一些重要的工具酶。
一、限制性核酸内切酶● 定义：是一类能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
● 生理功能特性：切割降解入侵的外源DNA ，使得外源DNA 的入侵受到限制的现象。
（一）命名EcoR Ⅰ(E ：属名；co ：种名；R ：细菌株RY13的第一个字母；Ⅰ：发现次序)Eco Escherichia属名 Coli 种名 Ry13 株系编号（三）基本特性1、识别特定序列✧绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
✧识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。
2、切割方式：由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：（1）产生平末端在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成平头双链末端，称为平整末端。
【书上p15图】（2）产生粘性末端限制性内切酶交错切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，可形成氢键，叫做~。
5’粘性末端【书上】3’粘性末端它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
基因工程基因工程工具酶
基因工程基因工程工具酶
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
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3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。
A.识别序列
• 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
• 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文 序列。
• 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种， 它们都呈回文结构。
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激 活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。
2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
l
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率
1、类型
特性 （7项）
I型
II型
III型
限制和修饰活 性
单一多功能的 酶
分开的核酸内 切酶和甲基化 酶
具有一种共同 亚基的双功能 的酶
• 以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
基因工程工具酶
基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
• 这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
• 在研究掌握了最好的基因工程“工 具”。
酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能
有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要有一 个统一的命名法。H．O．Smith和D． Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者 所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的第1个字母（大写）和种名的头 2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主 菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
核酸内切限制 酶的蛋白质结 构
3种不同的亚基
单链多肽
2种不同的亚基
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机寄地主切特割异 性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
十分有用
用处不大
切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。 有了它，又知道DNA序列的长度，就可以估算该限制性核酸 内切酶在某种DNA分子中的切点数N。
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、识别序列在DNA 分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种 脱氧核苷酸组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果某限 制性核酸内切
（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
限制性核酸内切酶的命名
Escherich Coli ia
Ry13
EcoR I
属名
种名
株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名 的第一和第三个字母。
（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、 HindIII等等。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
不同核酸内切酶的特异识别位点
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现 1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书 》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已 从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可 识别230种不同的DNA序列。
A.识别序列
• 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
• 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文 序列。
• 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种， 它们都呈回文结构。
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激 活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。
2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率
1、类型
特性 （7项）
I型
II型
III型
限制和修饰活 性
单一多功能的 酶
分开的核酸内 切酶和甲基化 酶
具有一种共同 亚基的双功能 的酶
• 以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
基因工程工具酶
基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
• 这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
• 在研究掌握了最好的基因工程“工 具”。
酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能
有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要有一 个统一的命名法。H．O．Smith和D． Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者 所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的第1个字母（大写）和种名的头 2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主 菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
核酸内切限制 酶的蛋白质结 构
3种不同的亚基
单链多肽
2种不同的亚基
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机寄地主切特割异 性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
十分有用
用处不大
切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。 有了它，又知道DNA序列的长度，就可以估算该限制性核酸 内切酶在某种DNA分子中的切点数N。
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、识别序列在DNA 分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种 脱氧核苷酸组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果某限 制性核酸内切
（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
限制性核酸内切酶的命名
Escherich Coli ia
Ry13
EcoR I
属名
种名
株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名 的第一和第三个字母。
（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、 HindIII等等。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
不同核酸内切酶的特异识别位点
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现 1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书 》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已 从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可 识别230种不同的DNA序列。