单细胞测序(测序公司培训)PPT精选文档
测序PPT
生工Sangon Biotech
α-互补
• 即：携带lacz’基因的质粒编码的α肽链和宿 主编码的N端有缺陷的β半乳糖苷酶突变体 互补，产生完整β半乳糖苷酶的能力——把 X-gal分解成蓝色物质的能力。
生工Sangon Biotech
TA克隆的优点
• 1、不需使用含限制酶序列的引物
• 2、不需要把PCR产物优化 • 3、不需要把PCR产物平末端处理 • 4、不需要把PCR产物加接头
生工Sangon Biotech
克隆测序要求
• 1、PCR以纯化：浓度≥20ng/ul，体积20ul • 2、PCR未纯化：浓度≥50ng/ul，体积25ul • 3、务必订单上注明PCR所用引物序列，以 便用于克隆结果的核对分析 • 4、克隆片段信息：名称、大小、样品是否 带A尾以及PCR产物类型
• 4、质
粒：20ul,浓度>100ng
生工Sangon Biotech
样品处理
• 1、菌液：
过夜培养 质粒提取 鉴定 反应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
• 2、PCR未纯化：
纯 化 鉴定 反 应
结果报告
序列分析
上机测序
生工Sangon Biotech
样品处理
生工Sangon Biotech
样本要求
• 1、甘油菌或穿刺菌：请注明其培养基、抗 生素抗性、载体名称及是否需要诱导等信 息；
• 2、质粒DNA：浓度需≥ 100 ng/μl，总量≥ 1 μg，OD 值介于1.80～2.00 之间，并确保 DNA 没有发生降解。
生工Sangon Biotech
流
挑取克隆、液体 LB培养基培养
单细胞测序
单细胞测序-I单细胞测序（single cell sequencing）被《自然-方法》（nature method）杂志评为了2013年度生物技术。
2017年10月美国政府启动了以单细胞测序为基础的“人类细胞图谱计划”，这是可以与“人类基因组计划”相媲美的又一个伟大工程。
要了解单细胞测序，我们首先需要了解下何为测序？“单细胞测序技术”是基于“第二代测序技术”上世纪70年代末，Sanger发明了双脱氧链终止法也叫做Sanger测序法，Sanger测序法为基础的DNA测序技术我们把他称作“第一代测序技术”。
“人类基因组计划”就是基于“第一代测序技术”完成的，共花费了30亿美元和耗时15年的时间。
“第一代测序技术”成本高和低通量的问题，逐渐满足不了生命科学领域发展的需求。
经过不断的技术开发和改进，以Illumina公司为代表的“第二代测序技术”大大降低了测序的成本并且大幅度提高了测序通量，所以也被称作“高通量测序技术”。
过去10几年“第二代测序技术”得到了快速发展，甚至突破“摩尔定律”的发展规律，如今完成一个人类的全基因组价格只需要1000美元和几个工作日。
随着“第二代测序技术”的迅猛发展，使得对于每个细胞单独测序成为了可能。
正是“第一代测序技术”的技术革命完成了“人类基因组计划”，同样的“第二代测序技术”掀起的技术革命正在推动着“人类细胞图谱计划”的进行。
当我们了解了“单细胞测序”就是以“二代测序技术”为基础的测序技术，那么下一步就需要了解下什么是细胞？为什么我们要进行单细胞测序？人体的每个细胞都是独一无二的细胞是人体结构和功能的基本单位，每个人大约有40亿-60亿个独立的细胞。
如果把一个人体全部细胞比作地球上的所有人类的话，那么我们的细胞就像地球上每个独立的个人，正如地球上的每个人都是独一无二的，人体的每个细胞也是独一无二的。
人类生命最初只有一个受精卵细胞，从胚胎发育到个体成熟，人体内的细胞数量增加的同时，细胞与细胞间的差异也越来越大，即使来自同一个组织的细胞，最终有的分化成了神经元而有的细胞则变成了神经胶质细胞。
单细胞测序技术（singlecellsequencing）
单细胞测序技术（singlecellsequencing）前⾔单细胞⽣物学最近⼏年是⾮常热门的研究⽅向。
在这⼀领域中，最前沿的则是单细胞测序技术。
传统测序⽅法⼀次处理成千上万个细胞，得到的变异⽔平也是成千上万个细胞的平均后⽔平。
但是，就如同世界上没有完全相同的两⽚树叶⼀样，没有两个细胞是完全相同的。
所以，单细胞测序对于研究单个细胞就显得⾄关重要。
单细胞测序可以揭⽰出每个细胞独特的微妙变化，甚⾄可以揭⽰全新的细胞类型。
单细胞测序技术可谓是科技发展史上的⼀⼤创举，它极⼤地推进了基因组学领域，使不同细胞类型得以精细区分，使得科学家们在单细胞⽔平进⾏分⼦机制研究成为可能。
随着⾼通量RNA测序技术的发展，2009年，开发了第⼀个单细胞转录组测序技术。
到了2011年Nicholas等⼈开发了单细胞基因组测序技术。
2013年⼜开发出了单细胞全基因组DNA甲基化检测技术。
随后，科学家在细胞分选技术、核酸扩增技术、信噪⽐提⾼⽅⾯等进⾏不断优化和改进，也进⼀步开创了单细胞Hi-C、单细胞ChIP-seq、单细胞ATAC-seq技术等。
2017年单细胞测序在技术⽔平和应⽤层⾯上都更进⼀步发展，本周我们汇总了2017年单细胞测序技术层⾯的部分重要进展。
更多的信息请您继续关注⼀呼百诺。
SCI-seq2017年3⽉，美国俄勒冈的研究⼈员在Nature Methods上发表“Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing (doi:10.1038/nmeth.4154) ”⽂章，开发出⼀种SCI-seq (single-cell combinatorial indexed sequencing，单细胞组合标记测序技术)，多次对细胞进⾏条形码编码标记后对它们进⾏测序，可以同时构建上千个单细胞⽂库，检测体细胞拷贝数的变异。
这项技术极⼤的缩减了⽂库构建的成本，增加了检测细胞的数量，这对于体细胞变异的检测，尤其是在肿瘤进化过程中对细胞亚克隆变异研究具有重要价值。
单细胞测序
2、样本高度异质，细胞之间存在重要差异
肿瘤遗传异质性研究，如化疗前后细胞种群及疗效分析 神经元的差异机制 辐射前后细胞差异分析
B： 当延伸遇到另一条新链随 机引物时，Φ29 DNA聚合酶替 换掉引物继续延伸，形成支链 结构，新的引物会在支链上重 新结合延伸。
B
MALBAC、MDA、Bulk比较
MALBAC技术方法
• 结果
• Cnv图
MALBAC技术方法
单细胞测序技术应用
1、样本稀少，用常规方法无法进行基因组或转录组分析
微流控芯片分离技术
• 利用微加工技术，在硅、玻璃、聚二 甲基硅氧烷等材料上，根据需要制作各 种结构、大小的微米量级的管道进行实 验，结合微流控技术对细胞进行分离。 （亲和性、物理特征、电学性能、免疫 磁珠）
优势：通量大，检测灵敏度高、分析速度快、自动高效。
劣势：微流控自身限制；芯片设计难度大。
单细胞全基因组扩增技术
单细胞测序技术
单细胞测序技术背景 单细胞分离技术
单细胞全基因组扩增技术 单细胞测序技术应用
单细胞测序技术背景
• 大量细胞测序反映的是细胞群体中信号表达的均值， 或者代表其中在数量上占优势的细胞信息，单个细胞 的独有细胞特性被掩盖或者忽略。
• 从单个细胞获取完整的基因组信息的应用场景增多， 如：循环肿瘤细胞转录组分析、人胚胎发生最早期的 分化特征研究等。
优势：高准确度、高灵敏度、高通量、 技术成熟、标准统一。
劣势：需要大量的悬浮细胞作为原始材料，会影响低丰度细胞亚 群的产出；快速液流影响细胞活性和状态。
梯度稀释分离
• 通过将细胞进行梯度稀释，最终得到 单个细胞。适用于样本可以培养的研究 中，如单个大肠杆菌与原绿球藻进行基 因组测序。
《NGS基础培训》课件
诊断罕见遗传病
通过分析患者的基因变异，对罕见的遗传病进行确诊和病理 分析。
预测遗传风险
通过对家族遗传史的研究，预测患者或亲属患某种遗传疾病 的风险。
肿瘤个性化治疗
靶向治疗
通过基因测序找到肿瘤的特异基因变异，设计个性化治疗方案，提高治疗效 果和减少副作用。
免疫治疗
分析肿瘤细胞的免疫逃逸机制，为患者提供更加精准的免疫治疗。
单细胞RNA测序
通过对单个细胞进行RNA测序，研究细胞异质性和基因表达的复杂性，具有 更高的灵敏度和分辨率。
单细胞DNA测序
通过对单个细胞进行DNA测序，研究基因组变异和遗传多样性，具有更高的 灵敏度和分辨率。
空间转录组测序技术
空间RNA测序
通过对组织样本进行空间定位，研究基因表达的空间分布和细胞异质性，为研究 复杂的生物组织提供新的工具。
VS
详细描述
序列组装是将测序得到的数千至上百万条 序列拼接成较大片段的过程，需要使用高 效的算法和计算资源。基因组构建是在序 列组装完成后，利用生物信息学手段将获 得的基因组组装成完整的图谱。这些步骤 对于研究生物体的基因组变异、基因结构 和功能等具有重要意义。
03
ngs在临床医学中的应用
遗传疾病的诊断与预测
数据质量控制与处理
数据质量评估
采用FASTQC等工具对数据质量进行评估，确保数据质量符 合要求。
数据过滤与去噪
使用Trimmomatic、Novoalign等工具进行数据过滤和去噪 ，以提高数据质量。
基因变异检测与注释
基因变异检测方法
采用SOAPsnp、GATK等工具进行基因变异检测，并依据SNP位点在基因组 上的位置进行注释。
《ngs基础培训》课件
单细胞测序技术课件
逆转录与cDNA合成 使用逆转录酶将建原理
将逆转录合成的cDNA进行一 录
• 单细胞测序技术概述 • 单细胞测序技术原理 • 单细胞测序实验设计 • 单细胞测序数据分析 • 单细胞测序技术的应用案例 • 单细胞测序技术的未来发展与挑战
contents
01
单细胞测序技术概述
定义与特点
定义
单细胞测序技术是一种高通量的分子 生物学技术，可以对单个细胞进行基 因组、转录组或表观组测序，以揭示 进行酶切、连接和文 库构建，以便后续的测序 分析。
技术优势与局限性
优势
能够对单个细胞进行基因组或转录组 分析，分辨率高，能够揭示细胞异质 性。
局限性
由于技术复杂度高，成本较高，且存 在一定的误差率。
03
单细胞测序实验设计
实验准备
确定研究目标
在开始单细胞测序实验前，需要明确研究目标，例如鉴定特定组 织或疾病中的细胞类型、分析细胞发育过程等。
预测模型构建
基于单细胞测序数据，构建预测模型，用于 疾病诊断、药物筛选和个性化治疗等。
技术伦理与法规问题
数据隐私保护
确保单细胞测序数据的隐私保护，防止数据泄露和 滥用。
伦理审查与知情同意
建立严格的伦理审查机制，确保单细胞测序技术的 合理使用和伦理规范。
法规监管
制定相关法规和政策，规范单细胞测序技术的研发 和应用，保障科技发展的安全和可控性。
应用领域
基础研究
01
用于揭示细胞发育、分化、功能和相互作用的机制，以及探索
疾病发生、发展和治疗的分子机制。
单细胞测序技术PPT培训课件
扩增引物 Phi 29 DNA聚合酶 基因组模板DNA
MALBAC法扩增
5’端有通用 扩增序列的 DNA片段
第一个循环下来，得到的是一批5’端有通用扩增序列的DNA片段
单细胞测序技 术
背景
过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、 癌症基因组计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向 高潮。
我们能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是 一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个 细胞独有的特性被忽视。另外有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不 足以进行全基因组分析，因此全基因组测序遇到难题。
第二个要解决的难题，这里是利用Phi29聚合酶能一次在模板上聚合出多个新链 的功能来达到这个目的。在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n2个扩增片段， 这样就可解决的问题，高效率扩增，还是利用了Phi29聚合酶的一次得到多个扩 增片段的效果来达成的。
请大家批评指正！ 谢谢！
MDA扩增图
MDA方法的技术核心是用Phi29DNA聚合酶来进行直接的扩增，Phi29DNA聚合酶可 以把双链DNA进行解链，然后在常温条件下就把原始模板进行大量扩增
两种方法比较
MDA的特点： 扩增效率更高，实验方法简单
MALBAC的特点： 扩增均一性更好； 得到的扩增DNA的量相对较少，或者说他的扩增效率相对较低
58℃退链火内杂交
完整扩增产物，自我 锁定，无法扩增
这样3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交，也就不会引发 新的、发始于3’端的扩增，这样就避免了完整扩增产物的指数扩增
单细胞测序技术及应用
CAR-T细胞的克隆动力学和单细胞转录谱分析
发表时间：2020 研究对象：B细胞恶性肿瘤 分离方法：流式细胞荧光分选
10X Genomics 建库策略：51、TCRB测序显示，CAR-T细胞克 隆多样性在IPs中最高，输注后下降。 2、scRNA-seq表明，输注后扩增的 克隆主要来源于输注的细胞毒性和 增殖基因表达更高的簇。 3、发现了与CAR-T细胞注射后行为 相关的转录机制。
80000个细胞； • 细胞捕获效率高：单个细胞捕获效率高达65%，可准确鉴别稀有细胞类型，利于稀有样本或小细胞量类型样本研究； • 多态率低：多态率（同一个GEM包含2个及2个以上细胞）低于0.9%/1000细胞。
样品前处理--制备细胞悬液
细胞清洗与过滤 细胞计数
活力评估
样品要求及悬浮液制备过程中注意事项
细胞过滤（除碎片、死细胞） 细胞计数>1000 cells/μl 上机
分离小鼠胚胎神经组织
神经组织
去除培养基至刚好没过组织
2 mL木瓜蛋白酶溶液 37 ℃，20 min孵育，
并轻轻搅拌 研磨组织
沉淀碎片 细胞清洗及过滤
细胞计数 上机
肿瘤组织
预冷1XDPBS清洗肿瘤 组织并剪碎
加入1X红细胞去除液
单细胞分析的扩增方法
转录组 基因组 表观基因组 蛋白质检测
扩增策略 全长RNA-Seq、mRNA末端标签扩增、靶向panel、IR-Seq MDA、MALBAC、DOP-PCR、靶向panel ATAC-seq、Hi成后进行质检及测序。细胞清洗及过滤
-20℃孵育30 min
细胞计数
-20℃或-80℃储存（6周以内） 或立即进行下一步
上机
苔原原生质体悬浮液
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扩增引物 Phi 29 DNA聚合酶 基因组模板DNA
MALBAC法扩增
PicoPLEX™ WGA Kit
单细胞转录组
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CNV(Copy number variation)分析
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单细胞SNV(single nucleotide variation)分析
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单细胞测序
主讲人：陈璟 2015/8/5
2013年，单细胞测序技术（single-cell sequencing）荣膺《自然-方法》年度 技术。单细胞测序技术有助于我们剖 析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细 胞基因组中发生的突变及结构性变异， 而这些突变和变异往往有着极高的突 变率。
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MDA扩增图