蛋白提取步骤
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
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蛋白提取步骤
蛋白提取步骤准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。
而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。
3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。
4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。
5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。
三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。
2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。
3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。
四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。
2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。
3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。
4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。
五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。
4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。
ripa蛋白提取方法
ripa蛋白提取方法RIPA蛋白提取方法引言蛋白质是细胞中重要的分子组成部分，它们在细胞的结构和功能中发挥着关键作用。
为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们经常需要从细胞中提取蛋白质。
RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）蛋白提取方法是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和注意事项。
材料和试剂1. RIPA缓冲液：包含盐、洗涤剂和缓冲剂，用于细胞裂解和蛋白质溶解。
2. 蛋白酶抑制剂：用于保护蛋白质免受降解。
3. 磷酸盐缓冲液：用于洗涤和溶解蛋白质。
4. 加热样品缓冲液：用于处理蛋白质样品。
步骤1. 收集细胞：将需要提取蛋白质的细胞收集到离心管中，可以通过离心将细胞沉淀下来。
2. 细胞裂解：向细胞中加入适量的RIPA缓冲液，使用离心机将细胞裂解开。
3. 离心：将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
4. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是含有蛋白质的部分。
5. 添加蛋白酶抑制剂：在上清液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质的降解。
6. 震荡和冷藏：将上清液和蛋白酶抑制剂混合均匀，并在4摄氏度下冷藏片刻。
7. 离心：将上清液离心，以去除任何未溶解的细胞碎片或沉淀。
8. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是蛋白质的最终提取物。
9. 加热样品：将提取的蛋白质样品加入加热样品缓冲液中，进行蛋白质的加热处理。
注意事项1. 所有的操作应该在冷藏条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 所有使用的器皿和工具都应该事先冷藏，以保持低温状态。
3. 在细胞裂解和上清液收集过程中，应尽量避免氧气的接触，以减少氧化反应对蛋白质的影响。
4. 在加热样品的过程中，应控制好加热时间和温度，以避免蛋白质的降解或变性。
总结RIPA蛋白提取方法是一种常用且有效的蛋白质提取方法。
通过细胞裂解和离心等步骤，可以得到含有蛋白质的上清液。
在提取过程中，需要注意保持低温、避免氧化和控制加热条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。
蛋白提取及WB步骤
Western blot 实验1）蛋白裂解液的配制:Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2）蛋白样品制备（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液0 0 200 μl 1 ml1 5 195 μl 1 ml2 10 190 μl 1 ml3 15 185 μl 1 ml4 20 180 μl 1 ml5 25 175 μl 1 ml我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
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提蛋白及WB得步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、
当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。
6ｍl离心
管、细胞刮板、开低温高速离心机
细胞裂解液配制:
1ml celｌlｙsis
10ul NP－40(离心机后)
25ul 焦磷酸钠
４0ul ＮaＦ
1ul β—甘油磷酸
2 ul Na3VO４
1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱)
10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒)
细胞裂解与收集
1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻
摇),倾斜贴壁吸走PBS。
2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。
１ml ),冰上静置１-２min。
3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从
上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、
细胞破碎
4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。
(超声波破碎仪得铁棒不要碰到
离心管得壁与底部)
超声波设置:
工作功率5% 工作时间３min
开机时间15s,关机时间３０s
温度０度,
报警温度1度
5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,)
蛋白保存
6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。
6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。
-80℃保
存。
注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。
样品处理超过１ｈ,补加一次。
ＢCA测定蛋白浓度
1、测空白板,选差异较小得孔。
BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595
2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。
取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
4、样品蛋白稀释2０倍:2ul蛋白+18ｕl PBＳ
5、配BCA:每个孔200uｌ,一个样品2个重复,Ａ:Ｂ＝５０:1,根据样品数来计算BＣA得用量,
一般防止损耗,多算一个样。
6、加BCA:悬空加、３7℃孵育30 miｎ。
(手不能碰板得底部,影响测定结果)
7、计时30min
8、配分离胶,灌胶,加水封。
9、计时2０min。
10、测蛋白:先振板、再设置参数。
11、计算上样体积:
12、配浓缩胶,灌胶,加梳子,等1—２ｍin,出现缩胶得地方补上。
13、打开干式加热器
10、蛋白质上样:根据计算结果乘以稀释倍数,算出蛋白浓度,以体积最大得为准,其她用水补足。
(最大上样量为20ｕl,除去buffｅｒ得体积,蛋白质最大上样体积为16ul)
标记0.6mｌ离心管
加样顺序:水、ｂuffer(１/４)、蛋白、离心—涡旋－离心。
100℃变性10miｎ(迅速,确保变性程度一致)
11、计时10min ,变性１０ｍｉn。
12、安装电泳槽:
电泳液(１Ｘ):配制:90ml(１0X)+8１０ml水(只能用一次)
液面刚覆盖胶,不能有气泡。
1３、上样:ｍaker 上样量为3uｌ。
依次上样(吸样品时最好一次吸完)枪头不能撬板,笔直打进去
１4、电泳
分离胶10０V,２0mｉn左右、条带都跑开即可。
浓缩胶14５V 1h 有等紫色部分跑到底结束。
转膜
准备工作:转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、ＰVDF膜
ＰＶDＦ膜用之前用甲醇浸泡数秒。
用海绵与滤纸之前先浸湿、
转膜:负极(黑板)海绵—三层滤纸－胶-PVDＦ膜—三层滤纸—海绵－正极(白板)、
三层滤纸与膜都需要赶气泡。
安装转移槽:加转子、冰盒,安装时夹子面朝上
15、转膜电压１00V 90min。
(视蛋白大小而定,蛋白分子小得可适当缩短时间)
１６、取膜晾干、剪个角作为标记,保鲜膜保存４℃。
孵育抗体
1、膜得活化:把膜晾干,甲醛浸泡(回收)膜数秒、无菌水洗3次、TBST洗２次。
2、封闭:配封闭液:３％得牛奶:4ｍl TBSＴ+ 0、12ｇ脱脂奶粉,混匀、涡旋。
3、4℃封闭一小时、盖盖子。
4、TBSＴ洗三次、每次１0 min 。
(封闭液与一抗相同则不用洗)
5、一抗孵育:加一抗,1:100０(比例视情况定)、密封孵育、盖盖子。
6、4℃过夜孵育。
7、回收一抗(回收到对应得离心管,立即放回4℃冰箱)
8、TBST洗三次、每次1０mｉn、
9、二抗孵育:加二抗,室温孵育１h。
１0、回收二抗,TBST洗3次,每次１0 ｍｉn(最后一次不要倒掉)(可以准备洗膜用得东西:检查显影液就是否能用)
显影
１1。
准备显影得东西:显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、
配发光液:Ａ:B 1:1、放小黑屋里、剪好保鲜膜、铺在板上,做好准备。
1２、最后一次TBＳT洗完后,拿到小黑屋,关门、开红灯。
13、先剪X光片、右上角做个记号(位置瞧个人习惯),
14、将膜上得液体吸干(卫生纸上稍微吸干),放板上,定一个3min 计时器,加上发光液,开始计时、观察发光现象,当瞧到发光时,压片。
１5。
压片:将膜反扣在保鲜膜上,不能产生气泡、每次压片都记时,先从２min开始。
1５、压片结束后,放在显影液里,轻轻摇晃至瞧到条带,用镊子夹至水中浸泡,清洗数秒,再放置定影液内、
16.等膜洗完后,拿至外间,用自来水清洗光片,晾干。