tnf流程图
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
肿瘤坏死因子的生产工艺设计说明书
肿瘤坏死因子的生产工艺设计说明书
肿瘤坏死因子（TNF）是一种细胞因子，可以诱导肿瘤细胞和病原体细胞的坏死。
TNF在医学上被用来治疗某些类型的癌症和自身免疫性疾病。
TNF的生产工艺设计需要遵循以下步骤：
1. 选取合适的菌株：选择能够高效产生TNF的合适菌株。
2. 制备接种菌种：将菌株接种于适宜培养基中，通过批次培养达到高效生产TNF的目的。
3. 筛选培养条件：根据菌株的生长特性和目标产物产率的关系，优化培养条件，包括温度、pH值、酸碱度、氧气供应等参数的设定。
4. 收获发酵物：在合适的时期，收获菌体或培养液。
5. TNF提取：在TNF基因表达的细胞或者培养液中提取目标蛋白，包括细胞裂解、超声波破碎、液液分离、离子交换层析、亲和层析、透析等操作。
6. TNF纯化：运用联合层析方法进行TNF的纯化和精制，包括无机盐沉淀、层析吸附、高效液相层析等方法。
7. TNF结晶：将TNF得到结晶并进行晶体形态学分析，以确定其活性和纯度。
8. 活性检测：利用TNF敏感细胞进行活性检测，包括细胞增殖率、DNA合成率、免疫细胞释放细胞因子等方法。
9. 包装与储存：将TNF制品进行过滤、灭菌、瓶装、标记、储存和配送等工序。
在整个生产流程中，需要严格控制各个环节的质量，确保生产的TNF符合药典规定的质量标准，并采用合适的技术手段监测和控制各个工艺环节的运行情况。
TNF-a说明书
人(human)肿瘤坏死因子a(TNF-a)说明书本试剂盒仅供研究使用标本：血清或者血浆一、试剂组成精密度微孔板96孔 (Microtitration Strips) 1块 2～8℃干燥保存酶标偶合液 (Conjugate ) 1瓶 12.0毫升 2～8℃冷藏保存标准品 (Standard) 5瓶各1.0毫升 2～8℃冷藏保存呈色剂A (Substrate A) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存呈色剂B (Substrate B) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存终止液 (Stopping Solution) 1瓶 6.0毫升室温保存20倍浓缩洗涤液 (Rinsing Buffer x 20) 1瓶 60.0毫升 2～8℃冷藏保存5倍浓缩样品稀释液 (Diluent x 5) 1瓶 15.0ml 2～8℃冷藏保存英文说明书，中文说明书各一份室温保存二、注意事项1. 此试剂为体外检测试剂，效期内使用，试剂应视为传染物，不同总批号的试剂不能混用。
2．使用前应将盒内各试剂取出。
室温放置至少30分钟，3．浓缩洗涤液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟。
4．浓缩样品稀释液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟5．若24小时内进行实验，标本可存放于2～8℃。
不需及时实验，标本-20℃保存，避免反复冻融。
6．在反复清洗微孔板，并扣干微孔中的残余液体，否则将降低精确度，造成吸光度偏离的假像。
7．加样完毕后，应注意轻微摇动微孔反应条，以便使孔中的液体充分混匀。
8．试剂盒保存于2～8℃，请勿冷冻，有效期请见盒内标示。
三、实验前准备1．使用前应将盒内各试剂取出，室温放置至少30分钟。
2．准备各种实验仪器及材料，如微量移液器，吸头，医用蒸馏水等3．浓缩洗液与医用蒸馏水1︰19倍稀释后成为应用洗涤液4．浓缩样品稀释液与医用蒸馏水1︰4倍稀释成应用样品稀释液5．用应用样品稀释液来稀释样品，按照1：100的体积比来稀释样品如10μl的样品加入到1ml的应用样品稀释液中，充分混匀待用。
TNF-——精选推荐
TNF-T N F 根据来源和结构不同分为T N F- a 、T N F -?，其中T N F-a 与⾻质疏松关系密切。
T N F 主要由单核巨噬细胞产⽣，另外，活化的T 细胞、⾃然杀伤细胞、肥⼤细胞、软⾻细胞也能分泌这种因⼦。
单核巨噬细胞合成的TN F 是⼀个25 ku 左右的⾮糖化跨膜蛋⽩，有两种不同的受体(P55 ，P75 ) ，其分⼦量分别为55 ku 和75 ku 。
T NF 与受体结合后，信号传⼈细胞内，通过N F -xB 或活化蛋⽩(A P )．1 转录因⼦来实现其功能。
⼈的TN F ．a 基因位于第 6 对染⾊体上。
1975年E.A. Carswell等⼈发现接种卡介苗的⼩⿏注射细菌脂多糖后，⾎清中出现⼀种能使多种肿瘤发⽣出⾎性坏死的物质，将其命名为肿瘤坏死因⼦（tumor necrosis factor，TNF)。
⼋⼗年代⼈们发现其在消耗症中起了重要作⽤，⼜称恶液质素。
TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产⽣。
1985年Shalaby把巨噬细胞产⽣的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产⽣的淋巴毒素（lymphotoxin，LT)命名为TNF-β。
虽然TNF-α与TNF-β仅有约30%的同源性，但它们却拥有共同的受体。
TNFα的⽣物学活性占TNF总活性的70 %～95 %，因此⽬前常说的TNF多指TNF-α。
1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第⼀个⽤于肿瘤⽣物疗法的细胞因⼦，但因其缺少靶向性且有严重的副作⽤，⽬前仅⽤于局部治疗。
⼈类TNF-α基因于1985年成功克隆，定位于6p21.4，长约3.6 kbp，有4个外显⼦和3个内含⼦，与主要组织相容性复合体（MHC）基因紧密连锁位于HLA-B 和 HLA-C2 位点之间的 MHC3 类基因区内，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNFα和TNFβ。
位于启动⼦区238位和308位存在单核苷酸多态性，被认为可调节TNF 的转录⽔平，与慢性⼄肝、⾃⾝免疫性疾病、胰岛素抵抗、肿瘤等多种疾病的易感性相关。
肿瘤坏死因子TNFα
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
实验室层析填料应用指南
咨询热线：800-810-9118 400-810-9118 网址：
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层析介质应用
2、分子筛技术：是利用多肽分子大小、形状差异来分离 纯化多肽物质。Superdex peptide 专门分离多肽类产品 的高分辨率分子筛凝胶，分离的分子量范围为 100-7000 Da。高化学稳定性 , pH 1-14, 兼容有机溶剂 ( 乙腈 +TFA)。
• 如果反相和离子交换技术都效果不好，原因可能是溶解 性的问题。
• 使用凝胶过滤如 Superdex peptide，Sephadex LH20 都 很好的用在多肽纯化中。
• 需要增加选择性，载量和稳定性：用多维纯化方法，可 以将离子交换，分子筛和反相层析等多种技术结合，而 代替一步反相或反复用反相柱子纯化。
常见的重组细胞因子有：干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤 坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、集落刺激因子 （colony-stimulating factor）、趋化因子（chemokine）、 生长因子（growth factor, GF）、白细胞介素系列（interleukin, IL) 等。
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GE 生命科学部层析技术应用部
二、多肽分离技术的综合运用
对于大多数的多肽来说，仅仅一步纯化或一种技术应用 是不够的，通常会将反相，离子交换和凝胶过滤这三种 技术综合起来进行多步纯化，最终达到高的分辨率。 例 1 、PY574a 多肽，14aa，pI>10, 在酸性条件下不溶。
一、原核表达细胞因子的纯化工艺
1、重组人干扰素 α2b(rh-IFNα2b) 的纯化：
大肠杆菌发酵
TNF介绍
一、TNF的发现及发展历史目前普遍认为，TNF最早是1975年由Carswell发现的。
Carswell在研究中观察到，经卡介苗致敏的小鼠被注射大肠杆菌内毒素后，血清中出现一种物质，该物质在体内可以使移植肿瘤发生出血、坏死，遂将该物质命名为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)[1]。
其实早在十九世纪后期，Coley等就观察到，当肿瘤患者伴有感染时，其肿瘤偶尔可以消退甚至痊愈。
基于这些发现，Coley等开始用一些灭活的G+和G-细菌混合物作为疫苗，来治疗恶性肿瘤，称为“Coley毒素”疗法[2]。
Coley毒素的应用，大大提高了软组织肿瘤患者的生存率，这在当时获得了较高的评价。
1936年，随着Coley的去世，人们对Coley菌苗的兴趣被广泛应用的化疗和放疗所取代。
100多年后的今天，当人们再次关注“Coley毒素”疗法的时候，发现该疗法的主要原理之一就是通过诱导体内产生大量的TNF来实现抗肿瘤作用的[3]。
自Carswell发现TNF后，许多学者进行的其他研究均观察到TNF在体外和体内对多种肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。
1984年Pennica等首次克隆了人TNF-α的cDNA，并在大肠杆菌中表达成功[4]。
随后，即有许多学者致力于将TNF 应用于临床的研究[5]。
自1987年起，在欧洲（德国、英国、法国、波兰、埃及等）、美国、日本等地陆续有进行TNFⅠ期和Ⅱ期临床试验的报道[6]。
但临床试验的结果给对TNF满怀希望的人们带来的是失望。
TNF类似严重感染所致的不良反应令患者难以耐受，而患者可以耐受的剂量似乎达不到抗肿瘤的浓度[7]。
一时间TNF的临床研究陷入了低谷，进一步的临床研究几乎停滞。
由于TNF明确的抗肿瘤活性，使得不少学者不愿轻易放弃对其的研究。
90年代中期以来，陆续有临床研究者报道了TNF局部用药的临床结果[8]。
证明TNF 局部用药（大剂量局部灌流、肿瘤内注射、腔内注射等）既可达到良好的抗肿瘤效果，又可避免全身用药的严重副作用，这一发现重新燃起了人们对TNF的热情。
四正柏生物 人类TNF-α ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ......................................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................................. - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................................. - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................................. - 5 -其他实验材料 ......................................................................................................................................................... - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................................. - 5 -样本收集处理及保存方法 ..................................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................................. - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................................. - 7 -操作流程图 ............................................................................................................................................................. - 8 -操作要点提示 ......................................................................................................................................................... - 8 -结果判断 ................................................................................................................................................................. - 9 -结果重复性 ........................................................................................................................................................... - 10 -灵敏度 ................................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ................................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ............................................................................................................................................................... - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
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TNF客網上操作流程
IT部USC
2010.12.13
輸入網址：https:// 輸入用戶名及密碼，點擊“Submit”進入，如圖page3.
（注：密碼會隔段時間更新，如密碼為001，更新為002，以此類推）
對於包裝，製作標籤等來說，主要應用兩個模塊，一是Move WIP，二是e—pack。
首先選擇Move WIP（Working In Process ），如page4所示。
在所標示的框中，輸入所需操作的PO（PO尾后加%，方可顯示全部信息），點擊“Find PO/Cut”，顯示此PO所有的信息。
點擊Move WIP下方的“車”的標誌。
進入page5.
在Select Stage 中選擇CUT，再點擊“Submit”顯示page6.
在Qty. to Move處輸入同Qty. Avail.一樣的數量，如圖所示，輸入3。
在點擊“Save WIP”進入page7
點擊“Post Wip Movement”
點擊“Make More WIP Movement”進入執行AUDT.
在Select Stage中選擇“AUDT”，再Qty. to Move 輸入3，再點擊“Save WIP”（注：當完成CUT時，會在CUT下顯示3）
點擊“Post Wip Movement”，進入下一個畫面。
點擊“Make More WIP Movement”完成MOVE WIP操作。
在e-sps中選擇e-pack.
在“Find PO/CUT”輸入剛剛完成Move WIP的PO%，點擊“Find PO/CUT”，顯示此PO的詳細情況，再點擊“Create Labels”小箱子，開始製作標籤。
（在填寫此畫面前，會有同事給你裝箱單，所填資料以裝箱單為主。
）在“Qty. Per Carton ”輸入裝箱單上所寫每箱所裝數量，再輸入總重量，凈重量，
箱子的長，寬，高。
再點擊“Post”製作標籤完成。
還會進入page14畫面。
（注：在裝箱單上一般寫箱子長寬高單位為尺寸，在填寫時需轉換，1英尺=2.54釐米）
當有尾數，點擊“Keep Packing”重複page13的操作。
都完成之後，在“e-SPS”中再選擇“e-Pack”會顯示page15的畫面。
在“Find PO/Cut“中輸入，剛操作完的PO%,點擊“Find PO/Cut”，顯示PO全信息再選擇“Print Labels”，進入page16.
在此選擇需打印的範圍，第一項為打印全部沒有打印的標籤；第二項為設置打印的頁碼，選擇性打印。
再選擇“Print Labels”。
顯示page17
顯示紙箱標籤的號碼及總數，點擊“Print”，顯示page18
標籤內容以記事本格式存儲，如果已經連接好印表機，點擊直接打印；如果還未連接好印表機，可點擊右鍵，另存為自己電腦上，待印表機設置好再打印。
如果在完成標籤后要更改標籤內容時，可點擊“Adjust Carton”，進入page20.
此畫面顯示了該PO的所有信息，點擊此PO，進入需該界面。
方框為可修改內容，一般長寬高及重量不修改，除非要更換紙箱。
大多數修改的為數量，即Update Units。
在某些情況下，標籤會棄用，我們需刪除此標籤，點擊“Delete Carton”顯示下圖，再勾選“Delete”，點擊“Delete Selected Cartons”，顯示page23.
顯示對話框，選擇“確定”刪除此標籤。