第四章++植物遗传转化技术
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
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3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
植物遗传工程研究植物遗传改良的技术和方法
植物遗传工程研究植物遗传改良的技术和方法植物遗传工程是一门综合性的科学，通过应用现代分子生物学和基因工程等先进技术，研究植物的遗传改良和基因转化。
在农业领域，植物遗传工程的研究对于提高作物的抗病害能力、增加产量以及提高品质具有重要意义。
本文将介绍一些常用的植物遗传工程技术和方法。
一、基因克隆和表达1. 重组 DNA 技术重组 DNA 技术是植物遗传工程的基础，它包括 DNA 片段的切割、连接、克隆等步骤。
首先，利用限制酶对目标 DNA 片段进行切割，然后将所需的 DNA 片段与载体 DNA 进行连接，形成重组 DNA。
最后，将重组 DNA 转化到宿主细胞中，并利用筛选标记来鉴定带有目标基因的细胞株。
2. 基因表达基因表达是指将外源基因成功转化到植物细胞中，并使其在细胞中进行表达。
常见的基因表达技术包括利用细菌介导的直接基因转化、农杆菌介导的转染、基因枪法等。
这些技术可以将外源基因导入到植物细胞的核或线粒体中，并通过转录和翻译过程使其在植物中表达出来。
二、基因编辑和突变1. CRISPR-Cas9 技术CRISPR-Cas9 是一种常用的基因编辑技术，它能够精确地修改植物的基因组。
该技术利用 CRISPR RNA 导向 Cas9 蛋白定位到目标 DNA 上，并通过剪切目标 DNA 来引发基因组编辑。
通过调整导向 RNA 的序列，可以精确地编辑植物基因组中的特定部分，实现基因的添加、删改或突变。
2. 诱导突变技术诱导突变技术是一种利用物理或化学方法诱导植物基因组中的突变。
常用的诱导突变方法包括化学物质诱导突变、辐射诱导突变和基因靶向突变等。
通过诱导突变，研究人员可以获得大量的突变体，进而研究突变体在形态、生理和遗传等方面的变化，为植物育种提供新的资源。
三、转基因和基因导入1. 转基因技术转基因技术是指将外源基因嵌入到植物的基因组中，并使其稳定遗传。
转基因技术在植物遗传改良中有着广泛的应用，例如通过转入特定基因来增强植物对病原体的抵抗力，或者提高植物的产量和质量等。
园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
园艺植物遗传转化
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第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
第四章植物遗传转化技术
卸甲载体
TL-DNA部分序列
pTiB6S3
LIH
pMON200
Kanr 同源重组
中间载体
转基因整合到植物基因组中
一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较
共同点: 两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组
而形成，故同属于一元载体系统。 不同点： • 受体Ti质粒与中间载体的结构不同。 • 同源序列不同。 • SEV是更有效的共整合载体。
• 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记 ）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的 基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后 构成。
• 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、
结构基因、终止子连接在一起构成基因。
中间表达载体-启动子及调控序列
• Ti质粒
Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似
实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发 现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定 地传给植物的后代。
Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重 要基础。
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质； 双股共价闭合的环状DNA分子； T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB； 植物基因工程常用的载体。
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒 结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)
植物遗传转化中存在的问题与对策
植物遗传转化中存在的问题与对策下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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植物遗传转化是一项重要的生物技术，通过改变植物的遗传信息，可以实现对其性状的改良和优化。
植物基因转化常用方法
一、植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类:一类就是直接基因转移技术,包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等,其中基因枪转化法就是代表。
另一类就是生物介导的转化方法,主要有农杆菌介导与病毒介导两种转化方法,其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高,广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二、农杆菌介导的基因转化方法(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染,而产生根瘤。
它就是一种革兰氏阴性土壤杆菌(A、tumefaciens)。
其致瘤特性就是由Ti(tumor－inducing)质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部就是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮与羟基乙酰丁香酮,这些酚类物质可以诱导Vir(Virulence region)基因的启动表达,Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下,而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合,形成复合物,转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因,其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素,促使植物创伤组织无限制地生长与分裂,形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱,冠瘿碱有四种类型:章鱼碱(octopine)、胭脂碱(nopaline)、农杆碱(agropine)、琥珀碱(succinamopine),使农杆菌生长必需的物质。
1、Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质就是Ti质粒后,Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外,Ti质粒上还存在Con区(region encoding conjugation)与Ori区(origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因与左右两个边界,LB与RB就是长为25bp的末端反复重复顺序,在切除及整合过程具有重要意义。
植物遗传改良的技术
植物遗传改良的技术植物遗传改良的技术是现代农业和植物育种的重要手段之一。
通过遗传改良，我们可以增加植物的产量、改善植物的品质、提高植物的抗病虫害能力，以满足人类对农作物的需求。
本文将介绍几种常见的植物遗传改良技术，并探讨其应用前景和影响。
一、杂交育种杂交育种是一种通过交配不同品种的植物，将其优良的性状遗传给后代的育种方法。
通过选择不同的亲本植物，并进行人工授粉，可以实现品种间的杂交。
杂交育种可以提高植物的产量和抗性，并增加植物的适应性。
例如，现在我们常见的水稻和小麦，就是通过杂交育种培育出来的高产品种。
二、基因编辑技术基因编辑技术是近年来快速发展的一种植物遗传改良技术。
它通过直接改变植物的基因组，实现对植物遗传性状的精确调控。
其中，CRISPR-Cas9是一种常用的基因编辑工具。
通过CRISPR-Cas9系统，研究人员可以精确地切割植物基因组中特定的基因，从而引发特定的基因突变。
利用基因编辑技术，人们可以改善植物的抗病虫害能力、增加植物的营养价值，甚至提高植物的耐逆性。
三、转基因技术转基因技术是一种将外源基因导入植物基因组中的方法。
通过转基因技术，人们可以向植物中引入一些特定的基因，以增加植物的产量、提高植物的抗病性或抗虫性。
转基因技术在植物遗传改良中具有重要的应用前景，但同时也引发了一些争议。
人们担心外源基因的导入可能对环境和人类健康造成潜在风险。
四、组织培养和胚胎移植技术组织培养和胚胎移植技术是一种通过细胞培养和组织修复的方法，实现对植物的遗传改良。
通过选取优良的植株组织，进行细胞培养和胚胎移植，可以快速繁殖和培育出大量的优良植株。
组织培养和胚胎移植技术可以加速植物的遗传进程，缩短育种周期。
总结起来，植物遗传改良的技术在农业生产和食品安全方面具有重要的意义。
通过杂交育种、基因编辑技术、转基因技术以及组织培养和胚胎移植技术，可以提高农作物的产量、提高植物的抗性、改善植物品质，以满足不断增长的人类需求。
植物遗传改良的技术和方法
植物遗传改良的技术和方法随着科技的不断发展和进步，人类开始了解到了植物的神奇之处。
然而，众所周知，植物的基本特征和性质是由基因所决定的。
这也导致了我们需要对其基因进行改良，从而提高其产量、抗病性等性质，以满足人们日益增长的需求。
而在这个过程中，一些新的技术和方法也兴起了。
植物的基因工程植物基因工程是指基于分子生物学和生物技术手段对植物基因的人工操作，进而改变植物的性状。
这种技术主要通过外源基因的引入来实现。
具体而言，就是将具有特定功能的外源基因，送入植物体内，从而使植物在基因上发生改变，产生新的或提高原有的性状，以满足人们的需要。
其中，诸如细菌和病毒等的载体是获取外源基因的一种重要工具。
通过将目标基因插入载体中，进行转化和筛选，最终将其送入植物体内进行基因的改变。
例如，将农业上常用的抗虫基因转移到植物中，以增强其抗虫能力。
还有一种方法是利用 CRISPR/Cas9 技术直接对基因进行修剪、割除、替换等操作，从而改造植物的性状。
这种方法同样在分子遗传改良领域中得到了广泛应用。
植物的转基因技术植物的转基因技术是指将外源基因转移进入植物体内，改变其性状和品质的一种技术。
转基因技术通过基因工程手段引入外源基因，使植物产生新的、有用的特性。
例如，将孔雀石绿基因转移到水稻中，使其产生抗虫、抗病功能，从而增加了水稻的生产量和产值。
通常情况下，转基因之前需要进行一系列的育种与选择工作，以获得适合基因工程的植物品种。
这些品种一般具有高生产力、较强的生命力、遗传稳定性等特性。
另外，采用转基因技术可以提高植物的抗逆性，如利用转基因方法标记抗干旱基因，可以生产出抗旱性强的植物品种，可以解决传统育种方法难以解决的问题。
植物的细胞工程植物细胞工程是指将人工合成的成熟植物细胞或非成熟植物细胞再生成为新的、原生态的植物体或某些器官（如根、茎、芽、花等），以实现对植物基因的遗传改良。
由于有很多植物品种是难以交配的，但如果我们能够通过体外培养的方法，将非正常部分细胞转变为正常植物细胞，那么整个植物就可以进行遗传改良。
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双元载体转化系统
基于T-DNA转移机制的两种特点：
• 对T-DNA转移和整合到植物染色体中起顺式作 用的仅仅是其末端24个重复序列。 • 能引起T-DNA转移和整合的毒性区(vir)基因 产物起反式作用，即Vir基因不必与T-DNA末 端重复序列位于同一质粒上，可由另一种质 粒提供。
双元载体转化系统-穿梭载体
多克隆位点
大肠杆菌质粒
重组质粒 农杆菌筛选标记
共整合转化 程序
农杆菌
大肠杆菌筛选标记
转化
大肠杆菌
细菌接合
T-DNA区同源整合
农杆菌
感染植物根部细胞
T-DNA区整合在植物细胞基因组上
一元载体转化系统-特点
• 由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成， 分子量较大； • 共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关, 相对较低； • 必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒 进行检测； • 构建时比较困难。
乙酰丁香酸 羟基乙酰丁香酸
根瘤菌细胞
Ti 质粒
单链 T-DNA
植物细胞
T-DNA的染色体 整合机制
表达 特异性核酸内切酶
在LB和RB的第三和第四个碱基之间切开
单链T-DNA整合在植物的基因组上
T-DNA的染色体整 合机制
Ti质粒 目的基因
天然Ti质粒存在的缺陷
中间表达载体的特性
中间表达载体
改良的Ti质粒 卸甲载体
的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并 且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合 基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。 • CaMV的35s启动子
花椰菜花叶病毒DNA的CaMV的35s启动子能使嵌 合的外源基因在植物细胞中表达。
目的基因
• 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中 分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的 新物种。
共整合载体的特点是：
• 中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重 组共整合而构建； • 中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是 pBR322
中间载体
pBR322 vector 目的基因 左边界（LB）
外源基因插入pGV3850的过程
pBR322（含AMPr） 胭脂合成酶基因（Nos) 右边界（RB）
中间表达载体-选择标记
供植物转化体的选择标记： • 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ) • 卡那霉素抗性基因(kanr) • 潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素 (hygr) • 氨苄青霉素抗性(Ampr) • 四环素抗性(Tcr ) • 庆大霉素抗性(Genr)
Cat（氯霉素乙酰移酶基因）
Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自 细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的 结构基因。
（5）花粉管转化
1 基因枪转化法 将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用 特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力 为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米 籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。
2 电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生 质体悬浮液中，混合物在 200-600V/cm 的 电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织 培养基中生长，再生出整株植物。
重组载体
卸甲载体
共整合载体
一元载体转化系统-拼接末端载体
拼接末端载体（sp1it-end vecter ,SEV）
• 1985年建立的，因它的两个LIH序列在同源 重组前分别处于不同质粒上而得名。
MCS LIH nptⅡ Sper/Strr pMON200 nos基因 中间载体 TR-DNA 目的基因 pMON200
• 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记） 加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基 因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构 成。 • 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、 结构基因、终止子连接在一起构成基因。
中间表达载体-启动子及调控序列
• Ti质粒
Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似
• 穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘 关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复 制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真 核生物中复制的载体。 • 这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择 标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS) 以及选择标记性状，具有多克隆位点。 • 通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基 因,在酵母菌中用于基因表达分析.
T-DNA（Transfer DNA） 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到 植物细胞的一段DNA； T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是 T-DNA的边缘区。 LB；RB 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口， 单链T-DNA进入植物细胞
植物根部
Ti 质粒致瘤的分子机制 损伤的植物根部会分泌 出乙酰丁香酸和羟基乙 酰丁香酸，它们能诱导 Ti质粒上的vir基因以及 根瘤菌染色体上的一个 操纵子表达。vir基因 产物将Ti质粒上的TDNA单链切下，而根瘤 菌染色体上的操纵子表 达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，后者 转化植物根部细胞。
Ti 质粒的改造 1、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生 物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再 生长为整株植物； 2、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为 有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞 的生长； 3、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短 载体的长度； 4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制， 以利于克隆操作； 5、安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物 基因的启动子和polyA化信号序列； 6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
第四章 植物遗传转化技术
植物遗传转化
• 植物遗传转化是指以植物器官、组织、细 胞或原生质体作为受体，通过某种技术或 途径转入外源基因，获得使外源基因稳定 表达的可育植株的过程。
植物遗传转化方法
植物遗传转化常用的方法 1、载体法转化——农杆菌介导法（Ti 质粒） 2、非载体介导的遗传转化 （1）基因枪法 （2）超声波法 （3）脂质体法（又称融合法） （4）电转化
电镜下的根癌农杆菌 冠瘿瘤
1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离
了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于
200kb），称为Ti质粒。
1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细 胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质 粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。 实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发 现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定 地传给植物的后代。
• 花粉管导入法的特点是直接、简便。 • 受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养 的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍， 特别适合于难以建立有效再生系统的植物。 • 由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或 早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。
5 农杆菌介导
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的 根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一 种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A. tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该 菌细胞内的野生型Ti （Tumor-inducing）质 粒介导的。
左边界（LB）
pBR322（含AMPr）
胭脂合成酶基因（Nos) 右边界（RB）
卸甲载体
中间表达载体 • 中间载体：
带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体 称为”中间载体” 原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合 转移的特性 目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置 换的T-DNA引入Ti质粒中。
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
Ti质粒结构
T-DNA区、毒性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒
结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)
Ti质粒结构
生长素合成基因
Onc基因
细胞分裂素合成基因 冠瘿碱合成基因合成基因
左边界LB
右边界RB Con区
Vir基因
复制起始位点
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，约占Ti质粒 总长度的1/3； 该区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性； Vir区段总长度约35kb，6S3
LIH
Kanr
pMON200
中间载体
同源重组
转基因整合到植物基因组中
一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较
共同点:
两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组 而形成，故同属于一元载体系统。 不同点： • 受体Ti质粒与中间载体的结构不同。 • 同源序列不同。 • SEV是更有效的共整合载体。
Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重 要基础。
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；
双股共价闭合的环状DNA分子；
T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表 达； 长度150-200KB；
植物基因工程常用的载体。
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分： • 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
转化载体系统
一元载体系统
构
建
双元载体系统
存在缺陷
• Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因工 程中难以操作； • 很难找到单一的酶切位点； • 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素 和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物； • Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在 大肠杆菌中复制。 • Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的 基因。