Northern Blot Presentation
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
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编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
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3、探针标记
探针模 模板、随 机引物 、双蒸
水。 冰块
离心、 混匀。 变性
顺序加
随机引
缓冲液
、dNTP 、dUTP
室温
Klenow 3h
酶，混
匀。
75°C 保温10 Min。
加预冷 无水乙 醇、混 匀。
1000r/min 15min、 去上清 、乙醇洗
-20 涤、真 ℃、 空干燥 2 h 、TE溶解
洗膜：在室温下用50mL 2*SSC， 0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或 储存备用（干燥环境中）。
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5.酶联免疫染色
室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。
用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。
[4] 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术[M].高等教育出版 社,2006,156-162.
[5] 汪天虹.分子生物学实验[M].北京大学出版社,2009,76-79.
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、-20°C 备用。
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4.杂交
将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按 20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交 液、68℃水浴摇床杂交1-2 h。
将标记好的DNA探针煮沸5min，迅 速在冰上冷却。将探针加入预热的杂 交液中，充分混匀。
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倒去预杂交液，按250mL/c㎡滤膜计 算向杂交袋中加入含地高辛标记探针 的杂交液，68℃杂交6 h以上。
Northern blot 分析
Northern blot分析RNA的提取和电泳（1）RNA的提取：以休眠解除不同时期的花芽为植物材料，采用Aidlab的EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒分别提取不同时期花芽的总RNA。
（2）制胶：将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热融化均匀。
待胶凉至60-70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS buffer和0.5μl EB，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
（3）RNA样品缓冲液：去离子甲酰胺50%，甲醛5%，10×MOPS1%，EB（1mg/ml）1%。
（4）样品制备：取DEPC处理过的500μl离心管，将每个样品25μg左右的RNA沉淀溶于30μl RNA样品缓冲液中，将离心管置于65℃水浴中保温10min，再置于冰上5min；每管中加入3μl甲醛凝胶加样缓冲液，混匀。
（5）上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1-2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔。
（6）电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于3-4V/cm的电压下电泳3-4h，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
试剂配制：（1）10×MOPS缓冲液：200mM MOPS；50mM NaAc；10mM EDTA；调pH值为7.0，过滤灭菌后，避光保存。
（2）甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25%(m/v)溴酚蓝；0.2mg/ml 溴化已锭（3）RNA样品缓冲液：10%10×MOPS缓冲液；17%甲醛；45%去离子甲酰胺转膜及烘膜（1）按胶块大小剪取膜一张，剪去膜一角，在DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡至使用时取出。
Northern-Blot印迹杂交.ppt
五、结果与分析：
THANK YOU!
13. 探针的纯化及比活性测定：
①准备凝胶：将1g 凝胶加入30 ml DEPC水中，浸 泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除 去可溶解的葡聚糖。换用新配的TE (pH 7.6)。
② 取1 ml 的注射器，去除内芯推扞，将注射器底 部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填 12Sephadex G-50。
冰上5 min。 ③ 短暂离心，将溶液收集到管底。
16．杂交： ① 加入0.5 ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀
后，将探针加到预杂交液中。 ② 42℃杂交过夜（14~24 h），杂交完后，将杂
交液收集起来于－20℃保存。
17．洗膜：加入High Stringency Wash Solution 2 (100cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42℃ 摇动 洗膜20 min两次。
5. 电泳： 将RNA样品小心加到点样孔中，5V/cm 下进行电泳（在电泳过程中，每隔30 min 短暂 停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续 电泳），当胶中的溴纷蓝接近胶的边缘时终止 电泳； 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测 量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离（注意不 要让胶在紫外灯下曝光太长时间）。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测 转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)。
11．将膜在-20℃保存。
12. 探针的制备：
① 在1.5ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 1μl；Random Primer 2 μl ； 灭菌水 11 μl ；总体积：14 μl 。
② 95 ℃加热3 min后，迅速放置于冰冷却5 min。
③在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
NorthernBlotting实验步骤
Northern Blotting实验步骤实验概要Northern杂交采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。
但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。
虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
实验步骤1. 总RNA提取2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备：取总RNA 30μg，加入甲醛4.0μl、甲酰胺12.5μl，上样缓冲液2.5μl。
65℃温育15min，迅速冰浴5min。
然后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。
以1×甲醛凝胶电泳缓冲液为电泳液，电泳结束后转膜。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：（1）．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
（2）．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
northern blot 的主要操作流程
northern blot 的主要操作流程Northern Blot 是一种用于检测样品中特定RNA 分子大小和数量的重要分子生物学技术。
下面是Northern Blot 的主要操作流程：1. 样品准备：选择适合的样品，可以是植物、动物或微生物的总RNA 提取物，或组织匀浆液等。
将样品在沸水中加热变性，以解开RNA 的二级结构，提高检测的灵敏度。
2. 凝胶电泳：将变性后的RNA 样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据分子量大小将不同大小的RNA 分开。
电泳结束后，将凝胶放入甲醛溶液中固定，以保持RNA 分子在凝胶中的位置。
3. 转膜：将固定好的凝胶放入Northern Blot 膜上，使凝胶中的RNA 分子按照大小顺序被转移到膜上。
这一步需要使用适当的缓冲液和转移膜，以确保转移过程的顺利进行。
4. 杂交：将膜在适量的预杂交液中杂交，以封闭膜上的非特异性位点。
然后，将杂交液中的探针加入到膜中，使探针与目标RNA 分子特异性结合。
5. 洗膜：在洗膜液中清洗杂交后的膜，以去除未结合的探针和其他杂质。
这一步需要使用适当的洗膜液和温度条件，以确保特异性杂交的信号被保留下来。
6. 检测：将杂交后的膜置于放射性自显影液或化学发光试剂中曝光，以检测目标RNA 分子杂交信号。
通过显影或发光信号，可以观察到特定大小的目标RNA 分子是否存在，并比较其相对丰度。
7. 数据分析：对Northern Blot 实验数据进行定量分析，比较不同样品中目标RNA 分子的大小和相对丰度。
这些数据可以用于进一步研究基因表达水平、转录本差异等生物学问题。
Northern Blot 技术是一种可靠的分子生物学方法，可以用于检测和定量分析样品中特定RNA 分子的表达水平。
该技术需要经过严格的实验操作和数据分析处理，以确保结果的准确性和可靠性。
核酸检测篇8-Northern blot_修正版
编号：2-8主题：Northern blot概述：Northern blot （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine、David Kemp和George Stark发明。
Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家Edwin Southern 名字来命名）来命名，Southern blot主要用来对DNA进行分析。
目的：Northern blot 可用来检测不同组织、器官、生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达模式，还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。
原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和用探针进行杂交检测RNA的表达水平。
步骤：1、总RNA提取；2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC 水12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min；3、样品制备：取总RNA约20-30μg，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0 μl、37%甲醛3.6 μl、甲酰胺10 μl，65℃温育15min、冰浴5min。
加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2小时左右），电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5、将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜；6、使上述RNA转移持续进行15hr左右。
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2015.10.10，魏铭
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Northern blot analysis: to detect transcription. Result: a lef-6 mRNA of was present from 4 to 48h
p.i., and trace amounts of this transcript may be
present at later times.
2015.10.10，魏铭
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• Southern blot analysis: to confirm the absence of lef-6 in the lef-6-null BACmid (vAclef6KO). • Result: lef-6 did delet on vAclef6KO.
2015.10.10，魏铭
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• Southern dot blot analysis: to
detect the viral DNA replication.
•
Result: deletion of lef-6 appeared
no affect on viral DNA replication.
2015.10.10，魏铭
Thanks.
2015.10.10，魏铭
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Functions: Detection of RNA ( gene expression, identification ). Procedure:
2015.10.10，魏铭
General Procedure:
• RNA extraction; (polyA tail & oligo T)
•
Conclusions: the lef-6 was not essential for either viral DNA replication or
late gene transcription, but the absence of lef-6 resulted in a substantial
2015.10.10，魏铭
• Applications
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Results: no affect on viral DNA replication and early transcription. Both late and very late transcription were delayed. This phenotype was rescued in viruses containing the reinserted lef-6 gene.
Northern Blot
• Basic imformation • Applications
2015.10.10，魏铭
Northern Blot
• Basic imformation
• • History: 1977; James Alwine, David Kemp,George Stark; Stanford University. Principle: Complementarity between detected RNA and probe.
2015.10.10，魏铭
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• Extesion: Reverse Northern Blot.
• Fix DNA on membrane and use cRNA as probe. • Advantage: • efficient in cDNA screening and identification by dot blot. • do not need electrophoresis.
2015.10.10，魏铭
• Applicaot: to detect transcription.
2015.10.10，魏铭
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2015.10.10，魏铭
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Results: no affect on early transcription. Both late and very late transcription were delayed. This phenotype was rescued in viruses containing the reinserted lef-6. Conclusions: the lef-6 was not essential for either viral DNA replication or late gene transcription, but the absence of lef-6 resulted in a substantial delay in late transcription. Therefore, lef-6 appears to accelerate the infection cycle of AcMNPV.
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Electrophoresis;
(size) Transmembrane; (+ & - charge) RNA fixing; Hybridization; Washing; Visualization.
2015.10.10，魏铭
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Previous study: LEF-6 is possibly a late transcription factor. Aim: to examine lef-6 in the context of the AcMNPV infection cycle. Methods: delet lef-6 gene from AcMNPV genome, then repair it.