利用相差显微镜观察FISH检测石蜡包埋组织切片的理想酶消化程度

均为 源 μ皂 厚的弥漫性大 月 细胞淋巴瘤石蜡包埋组织 芯片（愿圆 个点阵）切片经胃蛋白酶消化 猿园 皂蚤灶 后进行 蕴杂陨 贼 （员源；员愿）辕 陨郧匀 辕 月悦蕴鄄圆 的 云陨杂匀 探针检测，每张切片中仅约半 数点阵可检测到有效信号，且多数信号较弱，源园 倍镜下观察 不到信号，需 员园园 倍镜下才能观察到信号（ 表 员）。
［猿］摇 陈顺平援 云陨杂匀 中酶消化细胞的几点体会［ 允］援 临床与实验病 理学杂志，圆园员园，圆远（员）：员员远援
［源］摇 栽燥躁燥 酝，孕藻则藻扎鄄月藻糟藻则则葬 砸，灾葬扎择怎藻扎鄄月燥择怎藻贼藻 粤，藻贼 葬造援 蕴燥燥噪蚤灶早 枣燥则 枣藻则灶泽：燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 责则藻贼则藻葬贼皂藻灶贼 蚤灶 枣造怎燥则藻泽糟藻灶糟藻 蚤灶 泽蚤贼怎 澡赠遭则蚤凿蚤扎葬贼蚤燥灶（ 云陨杂匀）贼藻糟澡灶蚤择怎藻 燥灶 责葬则葬枣枣蚤灶鄄藻皂遭藻凿凿藻凿 贼蚤泽泽怎藻［泽 允］援 阅蚤葬择灶 酝燥造 孕葬贼澡燥造，圆园园愿，员苑（员）：缘怨 原 远猿援
孕值
源 μ皂 厚的淋巴瘤石蜡 愿圆
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圆园
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员援 园园 园援 园员 园援 园员
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园援 园园园 源 园援 园园苑 苑 园援 园园苑 苑
愿圆
源园 圆圆 员愿
园援 园园园 员 园援 园园园 员 园援 园园园 员
猿摇 讨论
镜下进行观察。未经酶消化或消化不够的切片镜下显示为 覆盖有大量网 格 样 物，消 化 理 想 的 切 片 显 示 为 网 格 样 物 消 失，细胞轮廓清楚。细胞轮廓皱缩则提示消化过度，这种情 况下进行杂交常仍能获得有效的杂交信号。若全片都显示 为核空洞或细胞消失时，需重新制片。
摇 摇 自 员怨远怨 年发展至今 云陨杂匀 检测技术操作程序得到了极 大简化［员］，临床 病 理 科 已 广 泛 应 用。 石 蜡 包 埋 组 织 切 片 的 云陨杂匀 检测流程中，酶消化是关键步骤。理想的酶消化状态 是获得清晰易判读的杂交信号。然而国内大多数实验室在 判断酶消化是否达到理想状态尚缺乏简便有效的手段。许 多工作人员根据文献报道或试剂盒推荐估计酶消化时间，在 酶消化后染 阅粤孕陨 于荧光显微镜下观察消化是否达到理想 状态，既浪费荧 光 染 料 又 增 加 了 汞 灯 的 损 耗，且 操 作 烦 琐。 而事实上国外实验室 云陨杂匀 检测已多采用相差显微镜来判断 酶的消化程度。本文现就采用相差显微镜观察判断 云陨杂匀 检 测石蜡包埋组织切片的酶消化程度的有效性作一探讨。
胃蛋白酶和蛋白酶 运 都可用于石蜡包埋组织切片的酶 消化过程［猿 原 苑］。有学者认为胃蛋白酶对石蜡包埋切片的消 化能力差，消化所需时间长，且胃蛋白酶极易失活，建议对石 蜡包埋组织切片的消化不宜采用胃蛋白酶而应采取活性较 强的蛋白酶 运［愿］。相较于胃蛋白酶，蛋白酶 运 是活性很强的 蛋白酶，且不容易变性，但如果浓度过高、消化时间过长或孵 育温度过高都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片 的脱落，细胞核消失（ 镜下显示为细胞核辨认不清或细胞核 呈空洞样改变），从而影响杂交结果。因此根据经验我们更 倾向使用胃蛋白酶对石蜡包埋组织切片进行消化，因为胃蛋 白酶较为温和，对细胞结构不容易造成破坏。有时理想的消 化状态把握不准，适当延长消化时间常只会导致轻微的消化 过度，不至引起重度消化过度而重新制片的后果。因此，只 要掌握适当的浓度及消化时间，胃蛋白酶较蛋白酶 运 更容 易获得细胞形态良好的理想消化效果。
微镜的使用万较方为数简据便，可直接在配置有相差镜头的光学显微
参考文献：
［员］摇 梁摇 毓，王 树 玉，贾 婵 维援 荧 光 原 位 杂 交 技 术 的 研 究 进 展 ［ 允］援 中国优生与遗传杂志，圆园园缘，员猿（缘）：员员怨 原 圆园援
［圆］摇 悦澡蚤灶 杂 云，阅葬蚤早燥 再，匀怎葬灶早 匀 耘，藻贼 葬造援 粤 泽蚤皂责造藻 葬灶凿 则藻造蚤葬遭造藻 责则藻鄄 贼则藻葬贼皂藻灶贼 责则燥贼燥糟燥造 枣葬糟蚤造蚤贼葬贼藻泽 枣造怎燥则藻泽糟藻灶贼 蚤灶 泽蚤贼怎 澡赠遭则蚤凿蚤扎葬贼蚤燥灶 燥灶 贼蚤泽鄄 泽怎藻 皂蚤糟则燥葬则则葬赠泽 燥枣 责葬则葬枣枣蚤灶 憎葬曾 藻皂遭藻凿凿藻凿 贼怎皂燥则 泽葬皂责造藻［泽 允］援 酝燥造 孕葬贼澡燥造，圆园园猿，缘远（缘）：圆苑缘 原 怨援
有时消化不够而不能获得可靠的杂交信号，只要再次消 化，重新杂交后仍能获得良好的杂交信号而不需重新制片。 这一经验对珍贵的样本或组织芯片的 云陨杂匀 检测尤为适用。 由于一张组织芯片上具有多个来自不同石蜡包埋切片的组 织点，因此一次消化难以做到每个组织点都达到理想的消化 程度，一 张 组 织 芯 片 云陨杂匀 检 测 的 成 功 率 一 般 为 苑园豫 耀 愿园豫 ，有时不到 缘园豫 。本实验提示对消化不完全的组织芯 片再次进行消化，云陨杂匀 检测成功率可达 员园园豫 ，不需要再重 新制片。
圆摇 结果
粤
月
图 员摇 相差显微镜观察石蜡包 埋组织切片胃蛋白酶消化情 况：粤援 未经酶消化；月援 消化程 度不够；悦援 理想消化状态
悦
收稿日期：圆园员圆 原 员员 原 园圆 作者单位：员 上海芯超生物科技有限公司摇 圆园员圆园猿
圆 复旦大学附属华东医院病理科，上海摇 圆园园园源园 猿 上海市医疗器械检测所摇 圆园员猿员愿 作者简介：陈摇 慧，女。耘鄄皂葬蚤造：糟澡藻灶澡怎蚤岳 泽澡遭蚤燥糟澡蚤责援 糟燥皂 殷于磊，男，主 任 医 师，通 讯 作 者。 栽藻造：（ 园圆员 ）远圆源愿猿员愿园鄄
临床与实验病理学杂志摇 允 悦造蚤灶 耘曾责 孕葬贼澡燥造摇 圆园员猿 允怎造；圆怨（苑）
·愿园怨·
利用相差 显 微 镜 观 察 云陨杂匀 检 测 石 蜡 包 埋 组 织 切片的理想酶消化程度
陈摇 慧员 ，陈摇 淳圆 ，王摇 华猿 ，陈摇 燕圆 ，殷于磊圆
关键词：相差显微镜；云陨杂匀；石蜡组织；胃酶消化 中图分类号：砸 源源远摇 摇 文献标志码：月 文章编号：员园园员 原 苑猿怨怨（圆园员猿）园苑 原 园愿园怨 原 园猿
大多数病理实验室都采用 员园豫 福尔马林作为标准的固 定剂。员园豫 福尔马林可以使 阅晕粤 或蛋白质的氨基团间形成 亚甲基网桥，这种交联作用使细胞质或细胞核内的各种生物 大分子形成网络，利于维持细胞结构和组织形态，但这样会 影响细胞膜的通透性，阻碍核酸探针的掺入［圆］。因此石蜡包 埋组织切片应在 云陨杂匀 杂交前进行前处理，杂交前处理包括 消化前高温预处理及酶消化处理。杂交前的酶消化处理是 云陨杂匀 检测的关键步骤［猿］，能对组织细胞进行部分的消化酶 解，去除核酸表面的蛋白质，增强组织的通透性和核酸探针 的穿透性。只有达到理想的消化状态，才能保证杂交信号清 晰、杂交结果稳定。而想统一使用一个理想的消化时间来保 证每个样本都能达到理想的消化状态几乎是不可能的，因为 组织类型、切片厚度、固定时间等都会使得理想的消化时间 发生改变。因此找到一个能有效观察消化程度的方法，以便 随时对消化程度进行控制显得十分必要。本组实验发现，使 用相差显微镜能有效判断理想的消化状态，明显提高杂交的 成功率及信号质量，提高工作效率，减少探针损耗。相差显
万方数据
圆园愿愿远，耘鄄皂葬蚤造：赠蚤灶赠怎造藻蚤圆园园员岳 赠葬澡燥燥援 糟燥皂援 糟灶
圆园 例源自本公司样本库 圆援 缘 μ皂 厚的弥漫性大 月 细胞 淋巴瘤组织切片经胃蛋白酶消化 猿园 皂蚤灶 后进行 蕴杂陨 （贼 员源； 员愿）辕 陨郧匀 辕 月悦蕴鄄圆 的 云陨杂匀 探针检测，均可检测到有效信号，其 中 苑 例样本信号较弱，源园 倍镜下未观察到信号，需 员园园 倍镜 下才能观察到信号。
员摇 材料与方法
员援 员摇 组织标本摇 从本公司组织样本库选取 圆园 例弥漫性大 月 细胞淋巴瘤石蜡包埋组织切片 圆 套，切片均为 圆郾 缘 μ皂 厚； 从外院病理科选取 圆园 例弥漫性大 月 细胞淋巴瘤石蜡包埋组 织切片 圆 套，切片厚度不详；选取具有 愿圆 个点阵的弥漫性大 月 细胞淋巴瘤石蜡包埋组织芯片切片 圆 套，切片厚度均为 源 μ皂（ 由本公司制片并切片）。 员援 圆 摇 试剂与仪器摇 主要试剂：胃蛋白酶（ 美国 粤皂则藻泽糟燥 公 司），探针 蕴杂陨 （贼 员源；员愿）辕 陨郧匀 辕 月悦蕴鄄圆（ 中国金菩嘉公司）。主 要仪器：荧光原位杂交成像分析系统（ 德国 在耘陨杂杂），原位杂 交仪（ 栽澡藻则皂燥月则蚤贼藻），相差显微镜（ 日本 晕蚤噪燥灶），电热恒温水 槽，隔水式恒温培养箱。 员援 猿摇 方法摇 （员）烤片：将组织切片置于 远缘 益 下过夜烘烤， 老化玻片。（圆）脱蜡：将烤好的切片浸入二甲苯中 员园 皂蚤灶 伊 猿 次，后经 员园园豫 乙醇脱水 缘 皂蚤灶 伊 圆 次，于室温下将组织切片 浸入去离子水中。（猿）酶消化前预处理：将组织切片浸入 怨园 益 水（ 责匀 苑郾 园）猿园 皂蚤灶，后用去离子水洗 缘 皂蚤灶 伊 圆 次。（源）胃 蛋白酶处理：使用 园郾 园员 皂燥造 辕 蕴 匀悦造 胃蛋白酶（园郾 缘 早 辕 蕴）于 猿苑
圆园 例来源于外院病理科厚度不详的弥漫性大 月 细胞淋 巴瘤组织切片经胃蛋白酶消化 猿园 皂蚤灶 后进行 蕴杂陨 （贼 员源；员愿）辕
·愿员园·
临床与实验病理学杂志摇 允 悦造蚤灶 耘曾责 孕葬贼澡燥造摇 圆园员猿 允怎造；圆怨（苑）
陨郧匀 辕 月悦蕴鄄圆 的 云陨杂匀 探针检测，仅 员园 例可检测到有效信号， 且其中 源 例信号较弱，需 员园园 倍镜下才能观察到信号，员园 例 无法检测到信号。
上述样本的另一套切片经胃蛋白酶消化 猿园 皂蚤灶 后在相 差显微镜下观察，对未达到理想消化状态的样本再次进行胃 蛋白酶消化，时间掌握适当，直至相差显微镜下观察达到理 想消化状态后进行 蕴杂陨 （贼 员源；员愿）辕 陨郧匀 辕 月悦蕴鄄圆 探针检测，所 有切片及组织芯片上的所有点阵均可检测到有效信号，且信 号明亮，源园 倍镜下即可观察到。较之胃蛋白酶消化 猿园 皂蚤灶 后即进行杂交，使用相差显微镜观察判断酶消化达到理想消 化状 态 后 再 进 行 杂 交 云陨杂匀 检 测，成 功 率 明 显 提 高（ 孕 约 园郾 园缘），杂交信号质量亦明显提高（ 孕 约 园郾 园缘，表 员）。