AGP手性柱应用实例课件
手性柱 CHIRALPAK AS-H
CHIRALPAK® 是大赛璐化学工业有限公司的注册商标。
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Nov 2005 Page 4
填料类型 直链淀粉衍生物
纤维素衍生物
纤维素衍生物 冠醚
配基交换 聚甲基丙烯酸酯
色谱柱名称
CHIRALPAK® AD CHIRALPAK® AD-H CHIRALPAK® AD-RH
CHIRALPAK® AS CHIRALPAK® AS-H CHIRALPAK® AS-RH
0.5 ml/min 0.2-0.3 ml/min
250 x 10 mm ID 5.0 to 7.0 ml/min 2.0 to 3.0 ml/min
1.0 ml/min
250 x 20 mm ID 18 to 25 ml/min 5.0 to 8.0 ml/min 3.0 to 5.0 ml/min
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B – 流动相添加剂
如果分离碱性或者酸性化合物，可 能需要在流动相加入少量添加剂
u 可用于分离伯胺样品 v 可用于分离伯胺醇样品
碱性样品 需要
碱性添加剂 二乙胺(DEA)
丁胺(Butyl amineu) 乙醇胺(Ethanol aminev)
< 0.5% 一般 0.1%
酸性样品 需要
酸性添加剂
三氟乙酸(TFA) 乙酸(CH3COOH)
操作限制:
流动相方向 典型流速c 柱压范围d 温度
150 x 4.6 mm ID 250 x 4.6 mm ID
分析柱
1.0 ml/min 不能超过 1.5ml/min
250 x 10 mm ID 半制备柱
参照色谱柱标签上的箭头
5.0 ml/min 不能超过 7ml/min < 50 Bar (约 700 psi)e 不能超过 100 Bar (约 1400 psi)
手性色谱柱使用手册
Nov 2005 Page 1请在使用色谱柱前仔细阅读本《使用手册》填料结构： 5μ硅胶表面涂布有纤维素-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]出厂保存溶剂： 正己烷 / 异丙醇（90:10 v/v ）该色谱柱在出厂之前都已经通过了检测，检测条件、结果和批号信息请查阅“出厂检测报告”。
150 x 4.6 mm ID 250 x 4.6 mm ID分析柱250 x 10 mm ID 半制备柱250 x 20 mm ID 半制备柱流动相方向 参照色谱柱标签上的箭头典型流速1.0 ml/min 不要超过 1.5 5.0 ml/min 不要超过7.0 ml/min 18 ml/min 不要超过25R =手性柱 CHIRALCEL ® OD-H使用手册33ml/minml/min柱压范围② < 50 Bar (约700 psi)③ 不要超过100 Bar (约1400 psi)温度 0 to 40°C①最大流速也和流动相粘度（流动相成分）有关，必须小心不能超过柱压上限。
② 柱压指色谱柱压降，即接上柱子后系统的压力与未接柱子时系统压力的差值。
③ 有助于柱子最长寿命的理想值，但是只要在50 Bar 之内柱子就没事。
A – 流动相❶ 烷烃：正己烷，异己烷或正戊烷，不同的烷烃有不同的选择性。
❷❑ 流动相中异丙醇换成乙醇，样品峰的保留时间缩短。
❑ 流动相中醇含量增加，样品峰的保留时间缩短。
❑可以使用正丙醇，正丁醇，异丁醇等醇类，但选择性会有差别。
❸甲醇在烷烃中的溶解性不好，正己烷中甲醇的最大含量是5％。
如果要烷烃中使用甲醇，最好同时加入一定量的乙醇。
❹ 摸索醇类流动相的配比时，可以选择从甲醇/乙醇50：50（v/v ）最为初始流动相。
❺CHIRALCEL ® OD-H 柱能使用100％的甲醇或乙腈。
然而一旦使用了极性流动相，这根色谱柱就只能一直用极性流动相。
如果要将正己烷换成甲醇或乙腈，或者要换成不同的极性溶剂，强烈建议使用100％的异丙醇作为过渡溶剂，过渡流速小一些（异丙醇粘度较大）。
手性药物HPLC分析课件
2003年世界销售额领先前10之一：
降血脂药辛伐他丁、PP胃T学习交酸流 分泌抑制剂艾美拉唑
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一、概述
固定比例（非消旋体）对映体药物
为产生最佳疗效需要开发两种对映体 固定比例的非消旋混合物.
茚达立酮是以消旋体形式上市的抗高血压药.右旋体 利尿作用,但引起尿酸滞留, 左旋体排尿酸作用,因此 确定两者比例消除不良反应,达最佳疗效.
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二、手性药物药学研究的基本思路
（一）合成过程中控制光学纯度
3. 消旋体的拆分
采用手性拆分试剂与外消旋的
中间体或终产品反应生成非对映异 构体,分离纯化得到所需的非对映 异构体,再去掉手性拆分试剂,从而 得到所需的手性药物.
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二、手性药物药学研究的基本思路
（一）合成过程中控制光学纯度
一、概述
(5) 两个对映体具有完全相同的药理作用
如普罗帕酮的两个对映体具有相同 的抗心率失常作用. 无需使用单一对映体.
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一、概述
对手性药物开发
消旋体药物？ 单一対映体药物？ 固定比例（非消旋体）对映体？
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一、概述
消旋体药物
两种对映体药理性质和治疗作用类似或互补； 对映体在体内有明显的外消旋作用或不稳定； 缺少对映体选择性合成途径； 无治疗作用的对映体无毒性或毒性可忽略.
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三、质量研究与质量标准
3. 分析方法专属性的验证
方法专属性的验证,可采用消旋 体或与对映异构体混和进样的方式 考察对映体间的分离度.
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三、质量研究与质量标准
2.1 原料药
【性状】项下的比旋度是手性药物的 特征之一,可以说明药品的光学特征 和纯度.
手型柱使用手册--ChiralpakAD-中文
Nov 2005 Page 1手性柱 CHIRALPAK? AD使用手册请在使用色谱柱前仔细阅读本《使用手册》色谱柱描述:10卩硅胶表面涂布有直链淀粉—三（3,5 —二甲苯基氨基甲酸酯）出厂保存溶剂： 正己烷/异丙醇（90:10 v/v ）0 to 40 ° C最大流速也和流动相粘度（流动相成分）有关，必须小心不能超过柱压上限流动相 250 x 4.6mm ID250 x 10mm ID 250 x 20mm ID 烷烃/醇类 90:10 1.0 to 1.5 ml/min5.0 to 7.0 ml/min 18 to 25 ml/min 100%乙醇0.5 ml/min 2.0 to 3.0 ml/min5.0 to 8.0 ml/min 100% 异丙醇0.2-0.3 ml/min1.0 ml/min3.0 to 5.0 ml/min柱压指色谱柱压降，即接上柱子后系统的压力与未接柱子时系统压力的差值。
填料结构: CH250 x 4.6 mm ID250 x 10 mm ID半制备柱250 x 20 mm ID半制备柱流动相方向 参照色谱柱标签上的箭头典型流速 1.0 ml/min 不要超过1.5ml/min 柱压范围5.0 ml/min 不要超过7ml/min< 30 Bar ( 约 430 psi) 不要超过50 Bar ( 约700 psi) 18 ml/min 不要超过25ml/min温度R =OCH该色谱柱在岀厂之前都已经通过了检测，检测条件、结果和批号信息请查阅“岀厂检测报告”。
有助于柱子最长寿命的理想值，但是只要在50 Bar之内柱子就没事。
A -流动相烷烃：正己烷，异己烷或正戊烷，不同的烷烃有不同的选择性。
己烷/乙醇5/15〜40/60的流动相会损坏固定相，从而影响基线稳定性。
如果要将15%乙醇换成60%乙醇的流动相，建议使用100 %的异丙醇作为过渡溶剂，过渡流速要小一些（异丙醇的粘度较大）。
手性药物分析PPT课件
排泄
肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢 过程，导致对映体间发生相互作用。
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随着对手性药物药理活性研究的不断深入，人们已经认识并开始重视手性 药物对映体生理作用和代谢过程的差别。特别是1992年美国食品与药品监督 管理局（FDA）提出发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的鉴定规定 后，如何能快速而准确的分离和测定手性药物已成为医药界关注的重大课题。
对衍生化反应的要求
➢手性衍生化试剂具有高的化学和光学纯度，且在贮存中不发生改变 ➢手性衍生化试剂和反应产物具有高的稳定性 ➢ 衍生化反应过程中产物不发生消旋化现象 ➢ 待测手性药物具有易于衍生的集团，如氨基、羟基、羧基等 ➢ 反应条件温和、快速、简便 ➢ 衍生化反应生成的非对映体在色谱分离时应能显示高柱效
手性配体交换固定相
通过手性金属配合物与对映异构体作用形成非对映异构体金属 配合物而进行手性拆分。主要用于α-氨基酸及其类似药物的手性拆 分。
用于形成金属配合物的离子均为过渡金属离子Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、 Cd(Ⅱ）、Zn（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）。
商品配体交换柱有Chiralpak WH和WM等。
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人α-酸性糖蛋白（ α-AGP）：多种类型药物 人血清白蛋白（HSA）：多种类型药物 牛血清白蛋白（BSA）：适于阴离子型手性化合物，如氨基酸及 其衍生物、芳香亚砜和香豆素类等 卵黏蛋白（OVM）：用于胺类和羧酸化合物的手性拆分 纤维素二糖水解酶（CBH）：适于分离多种类型的碱性药物。
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生化测定布洛芬对映体，提高了检测灵敏度
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AGP手性柱应用实例
Methods based on phosphate buffers or other nonvolatile buffers can easily be transformed to MS compatible methods by changing to ammonium acetate or ammonium formate buffers.
Retention and enantioselectivity No or low enantioselectivity and low retention Enantioselectivity and too high retention. Too high retention. No enantioselectivity.
Acetate Phosphate Citrate Tris Formate etc.
Influence of the buffer conc. on resolution and retention of the enantiomers of naproxen
0.01 M Sodium phosph. buffer pH 7.0
Another important tool in method development on CHIRAL-AGP:
Nature and concentration of uncharged organic modifier
2-propanol, 1-propanol
acetonitrile
ethanol, methanol etc.
Procyclidine Remoxipride
Pheniramine Nefopam
Separation of tricyclic basic drugs at low pH on CHIRAL-AGP 100x4.0 mm
AGP手性固定相分离6种药物对映体
增加 ,同时峰扩散严重 。如调节 pH 从 412 到 516,
奈哌地尔对映体间分离度由 116 增加到 410,但峰
高降低了近 5 倍 。pH 值在 412 ～518 内 , 6 种手性
药物均得到较好的分离 。
31212 盐溶液种类和浓度对分离的影响 采用磷
酸二氢钾溶液 ,西布曲明 、坦洛新分离色谱图
A - 奈哌地尔 ; B - 消旋卡多曲 ; C - 坦洛新 ; D - 西布曲明 ; E - 罗格列酮 ; F 卡维地洛 ; 1 - ( + ) 2S 2坦洛新 ; 2 - ( - ) 2R 2坦洛新
F ig1 2 Chromatogram s of six pharmaceutical racemates
N a tiona l Institu te for the Con trol of Pha rm aceu tica l and B iolog ica l P roducts, B eijing 100050, Ch ina)
ABSTRACT: O BJECT IVE To develop HPLC methods for the enantiomers separation of six pharmaceutical racemates including naftop idil, tam sulosin, carvedilol, racecadotril, sibutram ine and rosiglitazone1 M ETHOD S The separation was performed on chiral AGP with the mobile phase consisting of ammonium acetate or potassium dihydrogen phosphate solution2acetonitrile1 Several parameters on separation were studied1 RESUL TS Baseline separation was easily obtained in all cases1CO NCL US IO N The methods devel2 oped in this study can be used for separation of six pharmaceutical racemates conveniently1 KEY WO RD S:AGP; chiral stationary phase; chiral separation; enantiomer
手性色谱柱知识介绍（6）
蛋⽩质型： 蛋⽩质型⼿性⾊谱柱属于第5种类型。
分离依赖于疏⽔相互作⽤和极性相互作⽤。
已经有多种蛋⽩质⽤于此类⼿性⾊谱柱。
⽬前使⽤较多的是α-酸性糖蛋⽩（α-Acid Glycoprotein，AGP），⼈⾎清⽩蛋⽩（Human Serum Albumin，HSA），⽜⾎清⽩蛋⽩（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵类粘蛋⽩（Ovomucoid，OV）。
α-酸性糖蛋⽩分⼦由181个氨基酸残基和40个唾液酸（sialic acid）残基构成。
α-酸性糖蛋⽩分⼦偏酸性，等电点为2.7。
含有两个⼆硫键，性质很稳定。
α-酸性糖蛋⽩分⼦可以共价键合到硅胶上，制成⼿性⾊谱柱，可以分离许多化合物。
α-酸性糖蛋⽩⼿性⾊谱柱使⽤的流动相通常为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很⼩⽐例的有机相。
有机相⾸选异丙醇，如达不到分离要求，可以尝试⼄腈，⼄醇，甲醇或四氢呋喃。
有机相的改变导致蛋⽩结构发⽣暂时的改变。
⾊谱柱的负载量⾄关重要，典型的负载量为0.02mg/ml的浓度样品，进样20µl。
pH 的改变对⼿性选择性起关键作⽤，尤其是胺类化合物。
pH降低导致蛋⽩质负电荷的降低，引起胺类化合物保留时间减⼩，然⽽这意味着可以减⼩有机相⽐例，使选择性增加，峰形改善。
通过调节有机相⽐例仍⽆法达到分离效果时，有时需⽤电荷调节剂。
但这可能引起蛋⽩结构的永久改变，这些电荷调节剂包括丁酸、⾟酸、癸酸和⼆甲基⾟胺。
有时也⽤到1，2 亚⼄基⼆醇，1，2丁醇和氯化钠。
温度对分离也有影响，温度增加保留时间，减⼩分离因⼦。
⼈⾎清⽩蛋⽩（HSA）分⼦量为69,000，等电点为4.8。
蛋⽩中认为存在两个药物结合位点：华法令-氮杂普鲁帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基⼆氮杂-吲哚（benzodiazapine-indole）结合位点。
流动相中加⼊⾟酸，采⽤⼈⾎清⽩蛋⽩⼿性⾊谱柱可以有效分离benzodiazapine。
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pI = isoelectric point of AGP, i.e. the pH(2.7) where the protein has a net charge of zero.
pH effects - strong acids 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Increasing enantioselectivity
Increasing retention
Effect of organic modifier character on 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 enantioselectivity
Separation factor (a)
Enantioselectivity can be induced and improved by simple changes of the mobile phase composition.
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Optimization of enantioselectivity and retention
Most important tool in method development :
pH
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Net charge of pI
pH 4.0
pH 7.0
0
Increasing net negative charge of AGP at higher pH
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The AGP column has a unique property!!!
The chiral bonding properties of the stationary phase can be changed dynamically.
Analyte: Methylphenylcyanoacetic acid ethyl ester
Enantioselectivity
Retention
1.7
a 1.6
1.5
1.4
1.3 0
5
4
k´2 3
2
1
0
5
10
15
0
5
10
15
% 2-propanol
% 2-propanol
Decreasing modifier concentration
Alimemazine
Trimipramine
Dixyrazine
Cyamamezine
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Another important tool in method development on CHIRAL-AGP:
Nature and concentration of uncharged organic modifier
(R,S)
(S) (R)
(R) (S)
2-propanol (20%)
Methanol (36%)
1-propanol (16%)
(S) (R)
(S) (R)
Acetonitrile (20%)
Dimethylsulphoxide (15%)
Column: CHIRAL-AGP 150x4.0 mm Mobile phase: Organic modifier in 25 mM phosphate buffer pH 7.0
Methylphenobarbital
2- propanol
acetonitrile
1-propanol
Modifier conc. (M)
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2-propanol, 1-propanol
acetonitrile
ethanol, methanol etc.
Influence文档o仅f供参u考，n不c能作h为a科r学g依据e，d请勿模m仿；o如有d不i当f之ie处，r请c联系o网n站或c本e人删n除t。ration on retention and enantioselectivity
Separation of 2-phenoxypropionic acid at different pH
pH 7.0
pH 6.0
pH 5.0
pH 4
pH 7
0
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Propranolol Diperodon
Retention
pH
Uncharged modifier
- nature
- concentration
Buffer - concentration - nature
Charged modifier - nature - concentration
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Propranolol Diperodon
10 20 30 40 50
k´
pH 4
pH 7
0
Propranolol Diperodon
Propranolol Diperodon
1 Rs
2
3
Resolution
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pH effects - propranolol
pH 4.1 pH 7.0
Separati文o档n仅供参o考f，不b能a作为s科i学c依据d，请r勿u模g仿；s如有a不t当之l处o，w请联系p网H站或本o人n删除。CHIRALAGP 100x4.0 mm
Procyclidine
Remoxipride
Nefopam
Pheniramine
Separat文io档仅n供参o考，f不t能r作i为c科y学依c据l，ic请勿模b仿a；如s有i不c当之d处r，u请联g系s网站或a本t人删lo除。w pH on CHIRAL-AGP 100x4.0 mm