突变型人白细胞介素-2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

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中国生物化学与分子生物学报 )%%+ 年 $% 月 （D） ： $C ($, E ()F */01232 4567189 5: ;05</2=03>7? 81@ A592<6987 ;0595B? " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "
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材料和方法
材料
!"!"! 菌株与质粒 大肠杆菌 &6G">HI 本室传代， 酵母宿主菌 JAC" （ -)<9A+B K ） 、 酵母表达质粒 LG.5#J （大肠杆菌与酵母穿梭型质粒） 均为 .(M)B8E*@( 公司 产品 ! 质粒 L46$": （ 含天然人 ./01 ,234 全序列） 由 美国 N+*@(@ 公司胡应和博士馈赠 ! !"!"# 酶 和 其 它 试 剂 核 酸 工 具 酶 购 自 G8EO@*’ P)E=’Q 公司， R3P 购自北京经科化学试剂公司， ./01 标准品为中国药品生物制品检定所的产品， 中分子 量标准蛋白为 P)E0S’T 产品， 其它试剂均为国产或 进口分析纯试剂， U@<B@8( 印迹试剂盒购自 .(M)B8E*@( 公司， G5S 试剂盒购自 7’(*E( 生 物 工 程 公 司， G5S 引物由 N+*@(@ 公司合成 ! 大肠杆菌培养基： !"!"$ 培养基 （ ’） /P 培养基： "? 蛋白胨， "? 氯化钠， >V:? 酵母提取液； /4 培养 基： /P 加 ">> O* F / 氨 苄 青 霉 素， "> O* F / 四 环 素 ! （ Q） 酵母培养基：S2P： " OE= F / 山梨醇， "? 葡萄糖， （R@’<B 3)B8E*@( P’<@） ， "V%9? R3P 9 W "> K : ? 生物素， （ +, 谷氨酸， >V>>:? 氨基酸 +, 蛋氨酸，+ 0赖氨酸， +0 异亮氨酸） ； RG2 培养基： "? 酵母提取物， 1? 蛋白 胨， 1? 葡萄糖； PAXR 培养基： "? 酵母提取物， 1? 蛋白 胨， （ LN DV> ） ， ">> OOE= F / 磷 酸 缓 冲 液 "V%9? K: 将 R3P， 9 W "> ? 生物素， "? 甘油； PAAR 培养基： PAXR 中 "? 甘油代替为 >V:? 甲醇 ! !"# 方法 ! "#"! 引 物 设 计 及 G5S 扩 增 、 克隆 引物设计：
［$］ ［)］ 能 首次发现 !J’ K 自 $C&D 年 A57B81 及 M63<2>>0 等
其在临床上得到了广泛的应用 K !J’) 原自血 ) 以来，
收稿日期： 接受日期： )%%)’$$’%,， )%%+’%$’)F 重庆市科技委科研项目 （合同号： 渝科委计 $CCC’$(）
! 联系人
_29： %)+’(,)D)&,&， R’=809： 906?81C))a /5>=809 K <5=
刘堰， 女， 博士， 副教授 $C(& 年 C 月生， M2<20N2@： #5N2=\27 ,， )%%)； I<<2O>2@： 481687? )F， )%%+ （ #5K "6OO57>2@ \? B781> 5: */51BZ01B "<021<2 81@ _2</1505B? *5==0>>22 $CCC’$(）
［:］ 种蛋白， 其中包括 ./01 ! 但这一系统本身也存在着 若干缺陷， 从 "##C 年开始， 发展了酵母细胞表达系 ［%］
更谈不上变异 ./01 了 ! 我们将变异 ./01 基因插入醇 氧化酶启动子和信号肽后的多克隆位点上， 通过同 源重组将组装的 234 片段整合到酵母染色体 234 上， 达到变异 ./01 的分泌 !
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突变型人白细胞介素 !" 基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
， +） ! ， 胡应和)） 刘 堰$） ， 欧阳克清+） ， 蔡绍皙+）
（$） 西南师范大学生命科学学院，重庆
+） 美国 G6B212 公司，"81 H02B5，*IC)$+%； 重庆大学生物工程学院，重庆 F%%&$D；)）
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*57723O51@01B 86>/57 _29： %)+’(,)D)&,&； R’=809： 906?81C))a /5>=809 K &l突变型人白细胞介素01 基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
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液分离制备， 价格昂贵， 无法满足科研和临床应用的 需要 ! "#$% 年，&’()*+,-) 等 克隆了 ./01 的 ,234， 使 ./01 的大量生产和研究成为可能 ! 目前， 利用重 组 234 技术， 已在大肠杆菌、 酵母、 猴 567 细胞和昆 虫细胞等 中 获 得 表 达 有 生 物 活 性 的 8./01 ! 目 前 人 而且基因工 ./01 已经完全用基因工程的方法生产， 程 ./01 与天然 ./01 的功能和临床效果基本一致 ! 近年来， 虽然基因工程 ./01 应用于肝炎及某些 癌症的治疗已取得令人瞩目的成果， 但大剂量、 长时 间用药对病人仍然存在一定的毒副作用， 如发热、 寒 战、 恶心、 呕吐、 头晕、 乏力和毛细血管渗漏综合症 ! 因此， 有必要定向改造 ./01 的分子结构， 使其成为 具有高活性、 低毒性的超级 ./01 或具免疫抑制功能 的拮抗剂或部分拮抗剂， 后者用在治疗白血病、 自身 免疫病和抗移植物免疫排斥反应中阻断 ./01 活性 ! 为此， 国内外科学家们从 ./01 的结构和功能出发， 通过提示 ./01 结构亚区某些甚至单个氨基酸的功 能，采用蛋白质工程技术， 根据需要设计 ./01 的单 位点 到 多 位 点 突 变， 从 而 产 生 ./01 的 新 型 类 似 ［9］ 物 ! 我们选用的第一突变位点就是 "1: 位 5;< ! 比活性提高 %>? ， 4=’ ! 这样得到的变异重组人 ./01， 稳定性增强， 解决了 ./01 复性过程中易 7— 7 错配 导致无活性异构体或多聚体的产生 ! 人天然 ./01 的 "$ 位 /@+!A@B， "# 位 /@+! 7@8 可进一步提高其生物 学活性 ! 因此我们的第二、 第三突变位点就是上述的 最终得到一个三突变体 ./01 ! "$、 "# 位， 长期以来， 人们用大肠杆菌作为宿主表达了多
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摘要
为了提高人重组白细胞介素’) 的稳定性和活性以及减少毒副作用， 有必要定向改造 7/!J’) 的分子结构 K 用 L*M 法从白细胞介素’) （ !J’)） 并利用定点 <H#I 全序列中扩增成熟的肽基因片段， 突变技术将人重组白细胞介素’) 第 $)D 位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列 K 编码 $, 位 亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列； 编码 $C 位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列 K 突变型人白细胞介 素’) （AN!J’)） 基因与表达载体 OL!*CP 重组， 酶切线性化后用 !1N0>75B21 转化毕赤酵母试剂盒导入酵 母细 胞 进 行 整 合， 经 筛 选 得 到 一 高 表 达 白 介 素’) 的 克 隆 K "H"’LIQR 显 示， 表达量约占总量的 重组人白介素’) 有免疫活性； 与野生型 !J’) 相比， 所获得的突变型 !J’ FDS&T K 经 U23>271 印迹验证， & 比天然型 !J’) 高 F E D 倍 K ) 纯品的比活性为 FS% V $% !W - =B 蛋白， 关键词 人白细胞介素’)，定点突变，巴斯德毕赤酵母表达系统，活性表达 .&, 中图分类号
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