分子排阻色谱法
凝胶色谱法
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶色谱系统凝胶色谱仪凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
分子排阻柱色谱法
分子排阻柱色谱法
分子排阻柱色谱法是一种用于分离高分子量化合物的色谱技术。
这种色谱法也被称为凝胶色谱法。
它主要应用于大分子化合物，如蛋白质、多糖、核酸等的分离和分析。
以下是分子排阻柱色谱法的基本原理和步骤：
原理：
1.分子排阻效应：分子排阻柱色谱法利用凝胶柱（如琼脂糖或聚
丙烯酰胺凝胶）中的分子排阻效应。
大分子化合物在凝胶中的
排阻效应导致它们在柱上运动速度较慢，而小分子则能够更快
地通过凝胶。
2.大小分子的分离：样品通过柱时，大分子被凝胶阻挡，相对较
小的分子则能够穿过凝胶颗粒的间隙，实现分子的分离。
步骤：
1.样品准备：样品通常需要经过适当的前处理，如蛋白质的变性、
样品的过滤等。
2.柱选择：选择适当的分子排阻柱，柱内填充有凝胶。
凝胶的孔
径大小取决于待分离分子的分子量。
3.载气流动：通常使用溶剂或缓冲液作为载气，通过柱内凝胶，
使样品分子在柱中排阻。
4.检测：使用适当的检测器检测通过柱的化合物，如紫外可见光
检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：根据各组分在柱中的保留时间，可以得到样品中各
分子的相对含量和分子量。
分子排阻柱色谱法广泛应用于生物化学、生物医学、生命科学等领域，尤其是在对生物大分子进行分离和纯化方面具有重要意义。
分子排阻色谱法
附录Ⅴ H 分子排阻色谱法分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。
色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex ）和聚丙烯酰胺凝胶（Sepharose ）等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。
1.对仪器的一般要求分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。
在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC ）。
应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。
使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH 值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH 值在2～8范围。
流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过快，一般为0.5～1.0ml/min 。
2.系统适用性试验高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数（n ）、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：高单体与二聚体之间的谷二聚体的峰高 R 除另有规定外，分离度应大于2.0。
3.测定法（1）分子量测定法 一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定。
按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT ）和十二烷基硫酸钠（SDS ）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（M W ）的对数值对相应的保留时间（t R ）制得标准曲线的线性回归方程lgM W =a ＋bt R ，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
hplc分类
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。
分子排阻色谱法;吸附
分子排阻色谱法;吸附分子排阻色谱法（Size-exclusion Chromatography，SEC）是一种常见的色谱分析技术，它基于样品分子在分离柱中的不同透过程度，实现对分子的分离和鉴定。
而吸附则是SEC分析中的一个重要概念，它影响着样品分子与固定相之间的作用，从而对分离结果产生重要影响。
一、分子排阻色谱法的原理及特点分子排阻色谱法基于分子在柱中孔隙的不同透过程度，将分子进行分离。
具体而言，较大分子由于体积较大，无法进入小孔隙，因此在柱中的透过程度较低，保持在较早的洗脱峰；而较小分子则能进入更多的孔隙，透过程度较高，保持在较晚的洗脱峰。
这样，通过调节柱的孔隙大小，就可以实现对不同大小分子的分离。
分子排阻色谱法具有许多优点。
首先，它不需要样品的前处理，避免了溶剂选择和配制的繁琐步骤。
其次，SEC适用于各种种类的样品，包括有机溶剂、水溶液和高分子化合物等。
还有，SEC对样品的分散性和溶解度没有要求，因此，即使样品复杂或杂质较多，也能够得到准确的分离结果。
二、吸附对SEC分析的影响在分子排阻色谱法中，吸附效应是一个不可忽视的因素。
它指的是样品分子与固定相之间的相互作用，包括静电吸引、溶剂毒性等。
当分子与固定相之间的吸附作用较强时，样品分子容易被吸附在固定相上，从而导致分子在柱中的透过程度降低，分离效果变差。
针对吸附效应的影响，可以采取一些措施来减小吸附作用。
首先是选择合适的流动相，选择非极性溶剂或增加有机溶剂的含量，可以减少分子与固定相之间的相互作用。
其次是选择合适的固定相材料，如改进柱填料的表面特性，增强柱的亲水性或疏水性，都可以减小吸附的发生。
此外，控制温度、pH值等因素也对减小吸附效应具有重要作用。
三、分子排阻色谱法在实际应用中的意义分子排阻色谱法在许多领域中都有着广泛的应用。
首先，在药物研发中，分子排阻色谱法常用于药物分子的纯度分析、配方优化和质量控制等方面。
其次，在高分子材料领域，SEC可以用于分析高分子材料的分子量及分子量分布。
分子量大约为5000kd的蛋白质分子量检测体积排阻
为了测定分子量大约为5000kd（即5×10^6 Da）的蛋白质分子的分子量，采用体积排阻色谱法（SEC）是一种常用的方法。
这种方法基于分子流过凝胶孔洞时的排阻作用来分离不同大小的分子。
在体积排阻色谱中，凝胶或聚合物的孔径决定了它们能够分离的最大分子量。
通常，商用SEC柱的孔径范围从几百纳米到几微米不等。
因此，对于5×10^6 Da的蛋白质分子，需要选择孔径足够小的凝胶来确保其完全排阻。
具体的选择取决于所使用的SEC柱的规格和性能。
一般来说，对于这种分子量范围的蛋白质，使用具有较小孔径的SEC柱是一种理想的选择，如使用细粒度的Superdex或Toya Soka GEL。
在实际操作中，使用适当规格的SEC柱并遵循色谱柱的操作指南至关重要。
通过这种方式，可以获得准确且可靠的分子量测定结果。
同时，也可以根据所使用的设备规格和手册，进行具体的色谱柱选择和操作步骤。
排阻色谱法
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
排阻色谱法
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不 活泼性，故具有较高的稳定性。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 物质的分离。
（二）聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰 胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
分类：
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
（一）葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
排阻色谱法
一、简 介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝
胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂
（二）分类：
3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.51.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
主主要要是用水于。有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量
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测定方法
直接法：在测定淋出液浓度的同时，测定其粘 度或光散射，从而求出其分子量。 间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样 为标准样品，分别测定它们的淋出体积（保留 时间），建立保留时间与分子量二者之间的关 系，从而求出其分子量。
间接法
右中检所）
右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 41100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 84400； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物做一条 淋洗体积或淋洗时间和相对分子量对应关系曲线，称 为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准 样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下， 做一系列的GPC标准谱图，以重均分子量的对数值 (lgM)对保留时间(t)作图，所得曲线即为“校正曲线”。 通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对 分子量与相对分子量分布的信息。
测定方法
色谱条件与系统适用性试验 TSK G PWXL柱 柱温35℃ 进样量20µl 流动相：0.71%硫酸钠溶液(内含0.02%叠氮化钠) 0.5ml/min 取葡萄糖和葡聚糖2000，分别加流动相制成10mg/ml 的溶液，进样,测得保 留时间tT和t0，对照品溶液和供试品溶液的保留时间均应在tT和t0之间，理论板 数按葡萄糖峰计算不小于5000。 对照品溶液：取右旋糖酐分子量对照品(中检所) 适量，分别加流动相制成 10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 供试品溶液： 取供试品适量，加流动相制成10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 测定法：取对照品溶液，进样，用GPC软件计算回归方程。取供试品溶液， 同法测定，用GPC软件算出供试品的重均分子量及分子量分布。
分子排阻色谱法
测定多糖分子量及其分布
分离原理
凝胶渗透色谱 Gel Permeation Chromatography GPC 也称体积排阻色谱 Size Exclusion Chromatography SEC
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行 的路径有颗粒间的间隙（较大）和颗粒内的微孔（较小）。当聚合物溶液流经色 谱柱时，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒 之间，所以在洗脱时移动的速度较快（即保留时间短）；小分子物质除了可在凝 胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，洗脱时移动的速度要慢得多 （即保留时间长）。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子大小被分开，这 种现象叫分子筛效应。 分子筛效应。 分子筛效应
色谱柱的选用
亲水性球型高聚物为填充剂 （TSK G PWXL柱, Shodex OHpak SB HQ柱） 右旋糖酐铁 右旋糖酐20 右旋糖酐40 右旋糖酐70 TSK G2500 PWXL TSK G3000 PWXL TSK G4000 PWXL TSK G4000 PWXL
检测系统
多糖的检测，最常用的检测器为示差折光检测器 （通用型检测器）。通过连续地测定淋出液折光指数 的变化来测定样品的浓度，只要溶剂的折光指数与被 测样品的折光指数有区别均能检测。
谢谢
注意事项
1.在连接色谱柱之前，应该预先用即将使用的流动相置换以前用过的流 动相，注意控制流动相的流速，别超压（适用的压力范围说明书上很详 细）。 2.与常规的HPLC法相同，使用时流动相和样品过滤干净。 3.色谱柱用后用水冲洗，连接的检测器也要冲洗。绝对不能让盐保存在 检测器的池子里，否则一旦池子里的流动相挥发，盐会沉积在池子的表 面。池子污染后，再处理清洗是很麻烦的。 4.用0.05%叠氮化钠水溶液冲洗色谱柱，主要是为了防止长菌而影响柱 效。
色谱柱
各种色谱柱的孔隙大小分布有一定范围，有最大 极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的， 就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。 两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。 直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔 隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们 的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，色谱 柱有一定的使用范围。