仪器分析--分子排阻色谱法
仪器分析学习 第6章 色谱法导论-气相色谱
* 用时间表示 单位: s或cm
（1）保留时间 tR
试样从进样开始到柱后出现峰极大点
时所经历的时间(O´B)
（2）死时间
t 0
不被固定相吸附或溶解的气体（如：空
* 用体积表示 单位：mL
（1）保留体积 VR
从进样开始到出现峰极大所通过的
载气体积。 VR=tRF0 F0:柱出口处载气流速 mL/min
精选ppt
2）评价柱效的参数
理论塔板数(n)
n5.5(4tR )21(6tR)2
W 1/2
W
理论塔板高度（H） 有效理论塔板数
H L n
n有效 5.54 (W tR '1
)2
16 (tR ' )2 W
2
有效理论塔板高度
注意事项：
L H 有效 n有效
（1）n大，柱效高，分离好，前提是两组分分配系数K应有差
H A B /u C gu C luA B /u Cu
由此可知:流动相线速u一定时，仅在A、B、C较小时，塔板高 度H才能较小，柱效才较高；反之柱效较低，色谱 峰将展宽。
这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出 了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种 类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。
3) 塔板之间无分子扩散（忽略试样 的纵相扩散）
4) 组分在所有塔板上的分配精选系ppt 数保 持常数
精馏塔示意图
精选ppt
2、塔板理论之推导结论
1) 当组分进入色谱柱后，在每块塔板上进行两相间的分配， 塔板数越多，组分在柱内两相间达到分配平衡的次数也越 多，柱效越高，分离就越好。
n L H
n50 流出曲线呈基本对称的峰形； 当 n 达 103－106 流出曲线趋近于正态分布；
分子排阻柱色谱法
分子排阻柱色谱法
分子排阻柱色谱法是一种用于分离高分子量化合物的色谱技术。
这种色谱法也被称为凝胶色谱法。
它主要应用于大分子化合物，如蛋白质、多糖、核酸等的分离和分析。
以下是分子排阻柱色谱法的基本原理和步骤：
原理：
1.分子排阻效应：分子排阻柱色谱法利用凝胶柱（如琼脂糖或聚
丙烯酰胺凝胶）中的分子排阻效应。
大分子化合物在凝胶中的
排阻效应导致它们在柱上运动速度较慢，而小分子则能够更快
地通过凝胶。
2.大小分子的分离：样品通过柱时，大分子被凝胶阻挡，相对较
小的分子则能够穿过凝胶颗粒的间隙，实现分子的分离。
步骤：
1.样品准备：样品通常需要经过适当的前处理，如蛋白质的变性、
样品的过滤等。
2.柱选择：选择适当的分子排阻柱，柱内填充有凝胶。
凝胶的孔
径大小取决于待分离分子的分子量。
3.载气流动：通常使用溶剂或缓冲液作为载气，通过柱内凝胶，
使样品分子在柱中排阻。
4.检测：使用适当的检测器检测通过柱的化合物，如紫外可见光
检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：根据各组分在柱中的保留时间，可以得到样品中各
分子的相对含量和分子量。
分子排阻柱色谱法广泛应用于生物化学、生物医学、生命科学等领域，尤其是在对生物大分子进行分离和纯化方面具有重要意义。
分子排阻色谱法
测定方法
直接法：在测定淋出液浓度的同时，测定其粘 度或光散射，从而求出其分子量。 间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样 为标准样品，分别测定它们的淋出体积（保留 时间），建立保留时间与分子量二者之间的关 系，从而求出其分子量。
间接法
右中检所）
右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 41100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 84400； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物做一条 淋洗体积或淋洗时间和相对分子量对应关系曲线，称 为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准 样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下， 做一系列的GPC标准谱图，以重均分子量的对数值 (lgM)对保留时间(t)作图，所得曲线即为“校正曲线”。 通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对 分子量与相对分子量分布的信息。
测定方法
色谱条件与系统适用性试验 TSK G PWXL柱 柱温35℃ 进样量20µl 流动相：0.71%硫酸钠溶液(内含0.02%叠氮化钠) 0.5ml/min 取葡萄糖和葡聚糖2000，分别加流动相制成10mg/ml 的溶液，进样,测得保 留时间tT和t0，对照品溶液和供试品溶液的保留时间均应在tT和t0之间，理论板 数按葡萄糖峰计算不小于5000。 对照品溶液：取右旋糖酐分子量对照品(中检所) 适量，分别加流动相制成 10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 供试品溶液： 取供试品适量，加流动相制成10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 测定法：取对照品溶液，进样，用GPC软件计算回归方程。取供试品溶液， 同法测定，用GPC软件算出供试品的重均分子量及分子量分布。
仪器分析4大分析方法
附录V A 紫外-可见分光光度法（4）比色法供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比色法。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。
除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。
在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述（1）对照品比较法计算供试品浓度。
当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
附录ⅧA 电位滴定法与永停滴定法电位滴定法与永停滴定法是容量分析中用以确定终点或选择核对指示剂变色域的方法。
选用适当的电极系统可以作氧化还原法、中和法（水溶液或非水溶液）、沉淀法、重氮化法或水分测定法第一法等的终点指示。
1.电位滴定法选用两支不同的电极。
一支为指示电极，其电极电位随溶液中被分析成分的离子浓度的变化而变化；另一支为参比电极，其电极电位固定不变。
在到达滴定终点时，因被分析成分的离子浓度急剧变化而引起指示电极的电位突减或突增，此转折点称为突跃点。
2.永停滴定法采用两支相同的铂电极，当在电极间加一低电压（例如50mV）时，若电极在溶液中极化，则在未到滴定终点时，仅有很小或无电流通过；但当到达终点时，滴定液略有过剩，使电极去极化，溶液中即有电流通过，电流计指针突然偏转，不再回复。
反之，若电极由去极化变为极化，则电流计指针从有偏转回到零点，也不再变动。
仪器装置电位滴定可用电位滴定仪、酸度计或电位差计，永停滴定可用永停滴定仪。
电流计的灵敏度除另有规定外，测定水分时用10-6A／格，重氮化法用10-9A／格。
方法电极系统说明水溶液氧化还原法铂-饱和甘汞铂电极用加有少量三氯化铁的硝酸或用铬酸清洁液浸洗水溶液中和法玻璃-饱和甘汞非水溶液中和法玻璃-饱和甘汞饱和甘汞电极套管内装氯化钾的饱和无水甲醇溶液。
1.1.2 高效分子排阻色谱法的原理
高效分子排阻色谱法的原理
高效分子排阻色谱法是一种使用高效筛孔固定相进行分离的色谱方法。
其原理基于分子在固定相上的不同排阻效应，即分子与固定相的相互作用程度不同，从而实现分离。
具体原理如下：
1. 高效筛孔固定相：高效分子排阻色谱使用高效筛孔固定相，通常是一种多孔聚合物或硅胶。
固定相具有非常小的孔径和大的比表面积，可以提供较高的分离效果。
2. 排阻效应：在排阻分离过程中，分子在进入和通过固定相孔道的过程中，会与孔道表面发生相互作用。
较大分子大小的分子无法完全进入孔道，因此会以较快的速度通过固定相，而较小分子大小的分子则能够进入孔道，因此通过固定相的速度较慢。
3. 分子分离：基于排阻效应的原理，较大分子和较小分子在固定相上的吸附速度不同，从而实现分离。
较大分子无法进入孔道，流速较快，较小分子能够进入孔道，流速较慢。
4. 分析检测：在色谱柱的出口，通过检测器检测样品分子，根据不同分子的出现时间来判断其相对分子大小。
通常使用紫外可见光检测器或荧光检测器进行检测。
总结起来，高效分子排阻色谱法通过分析分子在高效筛孔固定相上的排阻效应，实现了分子的分离。
较大分子无法进入固定
相孔道，流速较快，而较小分子能够进入孔道，流速较慢，从而实现了分子的分离和检测。
gpc分子排阻色谱法
gpc分子排阻色谱法
GPC分子排阻色谱法是一种常用的色谱技术，用于分离和测定高分子化合物的分子量分布和平均分子量。
原理是分子在固定填料（凝胶）中的渗透性差异进行分离。
凝胶填料由多孔性材料组成，具有一定的孔径大小范围。
样品溶液中的大分子无法进入较小的孔径，因此在填料中被排除，而小分子可以进入更多的孔径，因此渗透性更高。
样品通过色谱柱时，较大的分子被更快地排除，而较小的分子则渗透更深。
这样，样品中不同分子大小的组分就可以在色谱柱中被分离开来。
适用范围
适用于对未知样品的探索分离，它能很快提供样品按分子大小组成的全面情况，并迅速判断样品是简单的还是复杂的混合合物，并提供样品中各组分的近似分子量。
这种分离方法不宜用于分子大小组成相似或分子大小仅差10%的组分分析，如同分异构体的分离不宜用分子排阻色谱法。
GPC的应用：
1.分子量测定：通过与一系列已知分子量的标准品进行比较，可以确定待测
样品的相对分子量或相对分子量分布。
2.分子量分布：分析样品中分子量的分布情况，得到分子量分布曲线，了解
高分子化合物的多分散性。
3.质量控制：用于确定产品的一致性和稳定性，检测分子量分布的变化。
4.聚合物合成：跟踪聚合反应过程中高分子的分子量变化，评估聚合度和反
应进程。
5.蛋白质研究：分析蛋白质的聚合态、聚集性质和分子量分布。
仪器分析4大分析方法
附录V A 紫外-可见分光光度法（4）比色法供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比色法。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。
除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。
在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述（1）对照品比较法计算供试品浓度。
当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
附录ⅧA 电位滴定法与永停滴定法电位滴定法与永停滴定法是容量分析中用以确定终点或选择核对指示剂变色域的方法。
选用适当的电极系统可以作氧化还原法、中和法（水溶液或非水溶液）、沉淀法、重氮化法或水分测定法第一法等的终点指示。
1.电位滴定法选用两支不同的电极。
一支为指示电极，其电极电位随溶液中被分析成分的离子浓度的变化而变化；另一支为参比电极，其电极电位固定不变。
在到达滴定终点时，因被分析成分的离子浓度急剧变化而引起指示电极的电位突减或突增，此转折点称为突跃点。
2.永停滴定法采用两支相同的铂电极，当在电极间加一低电压（例如50mV）时，若电极在溶液中极化，则在未到滴定终点时，仅有很小或无电流通过；但当到达终点时，滴定液略有过剩，使电极去极化，溶液中即有电流通过，电流计指针突然偏转，不再回复。
反之，若电极由去极化变为极化，则电流计指针从有偏转回到零点，也不再变动。
仪器装置电位滴定可用电位滴定仪、酸度计或电位差计，永停滴定可用永停滴定仪。
电流计的灵敏度除另有规定外，测定水分时用10-6A／格，重氮化法用10-9A／格。
方法电极系统说明水溶液氧化还原法铂-饱和甘汞铂电极用加有少量三氯化铁的硝酸或用铬酸清洁液浸洗水溶液中和法玻璃-饱和甘汞非水溶液中和法玻璃-饱和甘汞饱和甘汞电极套管内装氯化钾的饱和无水甲醇溶液。
排阻色谱法
排阻色谱法一、分离原理排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。
色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。
凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。
仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。
对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。
小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。
因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。
将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。
如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。
很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。
随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。
将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。
如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。
凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。
同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。
可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。
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仪器分析--分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。
色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶Sephadex和聚丙烯酰胺凝胶Sepherose等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。
1．对仪器的一般要求来源:考试大
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。
在药物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC）。
应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。
使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH值在2～8范围。
流动相中可进入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过高，一般为0.5～1.0ml/min.
2．系统适用性试验
高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中（1）色谱柱的理论板数（n）、（2）分离度、（3）重复性、（4）拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：
除另有规定外，分离度应小于2.0。
3．测定法
（1）分子量测定法
按各品种项下规定的方法，一般适用蛋白质多肽的分子量测定。
选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（MW）的对数对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程logMW=a+b tR，
供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。
在生物大分子聚合物分子量与分子量分布测定时，选用与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要。
按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜的GPC软件制得对照品重均分子量（MW）的对数对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程logMW=a+btR，供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
MW=∑（RIiMi）i/∑RI
D=MW/Mn
式中Mn为数均分子量；
MW为重均分子量；
D为分布系数；
RIi为供试品在保留时间i时的峰高；
Mi为供试品在保留时间时的分子量。
（3）高分子杂质测定法
高分子杂质系指药品中分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物和生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分子物质。
在正文品种规定的色谱条件下进行分离。
定量方法
①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。
一般用于高分子杂质含量较低的品种。
②面积归一化法同高效液相色谱法项下规定。
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物质的控制。
④自身对照外标法一般用于SephadexG-10凝胶色谱系统中β-内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。
在该分离系统中，除部分寡聚物外，β-内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，按外标法
计算药品中高分子杂质的相对百分含量。
［附注］SephadexG-10的处理方法。
色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶SephadexG-10用水浸泡48小时，使之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾入玻璃柱，一次性装满，然后用水将附着玻璃管壁的SephadexG-10洗下，使色谱柱面平整，新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，以排出柱中的气泡。
样品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将样品加在床的表面（此时，先将床表面的流动相吸干，将样品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3～5mL流动相，以洗下残留在色谱管壁的样品溶液）。