酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析教学讲义
酶的抑制剂与激活剂
Folin-酚法测碱性蛋白酶酶活原理
Folin-酚试剂在碱性条件下，其磷钼酸盐-磷钨酸 盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混 合物)。
在一定浓度范围内，蓝色深浅与含酚羟基氨基酸 (酪 氨酸)的量成正比，通过比较加入金属离子(或洗衣粉)后 和未加入金属离子(或洗衣粉)的反应酶液的OD680值，可 以推断出该种金属离子是该酶的激活剂还是抑制剂。
(4)反应结束时加入10%三氯醋酸溶液2 ml(终止反应) ， 立即摇匀，静置10 min。
(5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,离心1min 。取上 清1ml于试管中，各加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5ml及 福林一酚试剂1 ml，置于40℃显色15 min 。
(6)测定OD680值 ，并以原酶活力为100，算出相对酶活 。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和 底物，同样测定OD680值。
酶的抑制剂与激活剂
一.目的与内容
目的：学习研究酶的抑制剂和激活剂的方法，并通 过几种金属离子和表面活性剂对枯草杆菌碱性蛋白酶 活力的影响，筛选出该酶的某些抑制剂和激活剂。
内容：1.几种金属离子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和 Mg2+对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响；2.洗衣粉对枯 草杆菌碱性蛋白酶活力的影响。
2．洗衣粉对酶活力的影响： (1)分别在pH 7.0和pH 10.0酶液中加入洗衣粉(反应液
终浓度为0.03%)。 (2)混合液和pH7原酶液、 pH7空白(共4支)于25℃下放
置20 min。 (3)测酶活力，并以原酶活力为100，算出相对酶活。
五.注意事项
1.实验中，以先加TCA的酶液为空白，以原酶液试管为 标准液，对其操作应与实验试管同步一致。
实验10 酪氨酸酶动力学
v = C/t = A/L t ΔA v（mM/min） （A1- A0）
1
2
0.5
1.0
3 4
5 6
1.5 2.0
2.5 3.0
利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出 Vmax和Km。
酪氨酸酶动力学分析（双倒数作图）
2012.11 杨斯雷
【注意事项】
1. 量取试剂要准确。 2. 在比色杯中混匀要快速，准确计时。 3. 选择适宜的酶浓度，在1 min内A值的变化应在 0.2-0.3之间。
第二管（A) 0.477 0.554 0.611 0.672 0.726 0.780 0.838 0.901 0.960 1.010 1.060 1.100 1.132 1.174 1.208 1.211 未测定
A= 0.249
2012级 蒋斌杰 学号 1120700086
（二）米式常数的测定
以1.5ml 磷酸缓冲液调零。在另一个比色杯中，按下表依次 加入试剂，采用已确定的酶反应时间（t），分别记录各管 反应开始时A0 和 t 分钟后的A1。
4. 注意酶制剂要低温存放。
【思考题】
1. 为什么酶活力测定的是酶反应初速度？如何确定 酶反应时间？ 2. Km值的意义是什么？计算Km值的方法有哪些？
30
45 60 75 90 105 120
165
180 195 210 225 240 255
绘制产物A-t 反应进程曲线，确定测定酶反应初速度 所用反应时间（t）。一般A值变化在0.2-0.3/min。
时间（S） 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计
科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·118·2017年第13期文章编号：2095－6835（2017）13－0118－02酪氨酸酶结构功能分析及其抑制物的设计熊东彦，李志远，黄丹，慕昕，刘桢（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）摘要：黑色素生成与酪氨酸酶相关。
在保证健康的前提下，为了适当抑制黑色素生成，美白皮肤，我们使用生物信息学方法研究了酪氨酸酶的性质，并针对其性质设计了抑制分子。
利用遗传算法得到了不同物种的酪氨酸酶系统进化树，发现东非狒狒、猕猴等的酪氨酸酶与人类的具有较高的相似度。
在PDB数据库中预测到人类酪氨酸酶与巨大芽孢杆菌酪氨酸酶在空间结构上具有最大相似度。
N端与C端分别有1个β-折叠，N端与C端之间有多个α-螺旋。
由此发现，Zn2+和Cl-能够有效降低酪氨酸酶的活性。
黑色素合成受信号通路调控，JNK通路可以通过阻止cAMP应答元件结合蛋白来抑制酪氨酸酶的合成。
雌激素为黑色素合成的“第一信使”，其作用通过ER途径介导，由此寻找到抑制其活性的分子，比如埃克替尼、阿帕替尼。
关键词：酪氨酸酶；生物信息学；抑制分子；系统进化树中图分类号：S917.4文献标识码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2017.13.118黑色素是一种生物色素，能保护生物体免受紫外线伤害，过多的黑色素沉积易引发黑色素瘤。
黑色素合成受多个途径调控，其中，由酪氨酸酶参与的合成途径是黑色素合成的重要途径之一。
酪氨酸酶是一种氧化还原酶，广泛存在于各生物中，与生物体合成色素直接相关。
目前，酪氨酸酶在医疗美容方面的应用发展迅速。
随着生活水平的提高，人们对美的享受也越来越讲究，美白剂的开发随之成为化妆品行业关注的焦点之一。
目前，市场上的美白剂主要有熊果苷、曲酸等，文献表明这些物质均具有较好的美白功效，但这些物质具有一定的皮肤刺激性，或稳定性较差。
酪氨酸抑制性测定实验方案
熟地黄提取液对酪氨酸酶的抑制作用研究一、仪器和药品：仪器：分光光度计、微量移液器（1ml）、电子天平、容量瓶（10ml、50ml、250ml）、回流装置一套、沸石、抽滤装置、旋转蒸发仪、水浴恒温箱、烧杯和量筒若干。
药品：熟地黄粉末（约50g）、体积分数50%的乙醇（200ml）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去离子水若干。
二、实验方案：A、熟地黄有效成分的提取：1、干燥熟地黄粉末10.0 g + 体积分数50%的乙醇100mL，室温浸泡24 h。
2、烧瓶+沸石+上述浸泡液，回流提取3 h，冷却后抽滤取滤液。
残渣再次加50%乙醇100mL 回流提取3 h，冷却抽滤取滤液，合并两次滤液。
（回流温度约80℃。
）3、将滤液置于旋转蒸发仪上60-65℃浓缩回收溶剂，得膏状提取物。
4、称取适量膏状提取物+去离子水配置成1 mg/mL 溶液备用。
B、磷酸缓冲溶液（PBS）的配制：1、称取磷酸氢二钠13.3984 g，加去离子水溶解，转移至250mL 容量瓶中定容得a液；另称取磷酸二氢钠6.9011 g，加去离子水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得b液。
2、分别移取a、b两溶液各50mL至250mL容量瓶中，加去离子水定容，即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。
C、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制：1、称取L-酪氨酸25.6 g，用PBS缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。
2、称取酪氨酸酶0.3502 g，用PBS缓冲液定容于10mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。
（冰水浴中操作、保存。
）D、酪氨酸酶活力的测定：（分光光度法测A475）用微量移液器分别按表一剂量准确移取a、b、c、d四组样液，置于37℃水浴中恒温10 min后，各加入0.40mL酪氨酸酶溶液，混匀，37℃温育反应10 min，迅速移入比色皿中，测得在475nm处的吸光度A a、A b、A c、A d ，然后按下面的公式计算熟地提取液对酪氨酸酶的抑制率：抑制率=[1-（A d-A c）/（A b-A a）]×100%其中：a：既无底物也无提取物的待测液；b：有底物但无提取物的待测液；c：无底物但有提取物的待测液；d：既有底物也有提取物的待测液。
高中生物人教版必修一： 探究影响酪氨酸酶活性的因素及其应用 教案设计
探究影响酪氨酸酶活性的因素及其应用学校：辅仁高级中学指导教师：沈唯军一、教材分析自然界中的一切生命现象皆与酶的活动有关，教材在阐述酶在生物新陈代谢中的重要作用及其本质的基础上，通过本课的探究性实验，来探索影响酶活性的条件，培养学生建立科学的思维方法和研究精神。
二、教学目标：1、知识目标：学会控制自变量，观察和检测因变量的变化及设置对照组和实验组。
2、能力目标：学会用数学建模和准确的语言阐明实验探究的结果，概述温度和pH对酶活性的影响。
3、情感态度价值观：体验科学探究过程，领悟科学探究方法，体现团队合作精神。
三、教学重点和难点：教学重点1、学会控制自变量，观察和检测因变量的变化及设置对照组和实验组。
2、学会用数学建模和准确的语言阐明实验探究的结果。
3、学会在实践中运用相关实验结论教学难点：确定和控制对照实验中的自变量和无关变量，观察和检测因变量的变化。
四、学情分析:学生通过前期的酶学实验已经有了一定实验操作能力和控制变量的意识。
在此基础上指导学生完成实验的设计和实施是可行的。
因为H2O2受温度影响也会分解，而淀粉遇酸也会发生水解。
所以建议用α—淀粉酶来探究温度对酶活性的影响，而用过氧化氢酶来探究pH对酶活性的影响。
原实验设计难度较大，且需要准备大量的实验试剂和材料，而本实验采用采用是常见且廉价的实验材料蘑菇（含有酪氨酸酶），并且它们在实验设定的温度和pH中都相对稳定，不需要进行替换。
3、人教版课本“酶所需的作用条件实验的设计”是定性的实验，本实验通过对黑化程度的量化，实现了更精确的定量实验方式。
学生可以运用数学知识进行建模，通过自身来探索酶活性伴随温度﹑pH的变化趋势。
做到既关注知识结论，更关注知识的发生和发展过程，突出学生学习的主体地位。
L—半胱氨酸对酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶催化动力学
L—半胱氨酸对酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶催化动力学作者：方庆秋来源：《科技资讯》2015年第18期摘要：L-半胱氨酸对酪氨酸酶活性有抑制作用，随着L-半胱氨酸浓度的增加而酶活不断受到抑制，并且延滞时间也相应延长。
相对稳态酶活力则随着L-半胱氨酸浓度的增大而下降。
同时，对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理进行了研究，分析延滞时间产生的根本原因，提出了酪氨酸酶的单酚酶将醌转化为多巴黑色素的非酶反应偶联的反应机理，研究其对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理，为酪氨酸酶抑制剂的设计提供分子模板。
关键词：酪氨酸酶 L-半胱氨酸单酚酶二酚酶抑制动力学中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0116-02酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶，是白癜风免疫的重要抗原。
最近发现的白癜风患者血清中的酪氨酸酶抗体和白癜风密切相关。
可以使皮肤颜色通过抑制酪氨酸酶的活性，以防止皮肤黑色素的形成，即皮肤脱色剂。
将某些酪氨酸酶抑制剂应用于美白化妆品。
因此，寻找有效的和人体有无不良反应的酪氨酸酶抑制剂已成为医药和化妆品行业的研究和发展趋势。
该文以L-半胱氨酸作为效应物，研究其对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理，为酪氨酸酶抑制剂的分子设计的实际应用提供依据。
1 实验方法1.1 酪氨酸酶活力测定酪氨酸酶单酚酶活力测定：1.5mmol/LL-酪氨酸为底物，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的L-半胱氨酸溶液和酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。
酪氨酸酶二酚酶活力测定：1.0 mmol/LL-DOPA为底物，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的L-半胱氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。
2 结果与讨论2.1 L-半胱氨酸对酪氨酸酶单酚酶的影响图1可知，随着体系中L-半胱氨酸浓度的增加，抑制单酚酶酶活的能力不断增加。
酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究
仪器与试剂
仪器：分光光度计 植物组织捣碎机 离心 机 恒温水浴 试剂：pH6.8磷酸盐缓冲溶液 多巴溶液 （200mg/L） 铜试剂（10-3mol/L） 土豆
实验步骤
1.络氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，切碎，置于植物组 织捣碎机中，加入冷却的磷酸盐缓冲溶液150ml，在高速转 速下捣碎2分钟，然后倒入干净烧杯中静置2分钟，去上层清 液于离心式管中在3000r/min转速下离心分离5分钟。 2.Km和vmax的测定：在6支比色管中按表1加入缓冲溶液、多 巴溶液，摇匀、30℃恒温10min，再在00、0、1号比色管各 加入络氨酸酶提取液各0.20mL，摇匀后立即倒入比色皿中， 以00号为参比溶液，测量其吸光度，前5min每隔30s测量一 次溶液的吸光度，后5min每隔60s测量一次溶液的吸光度， 并记录溶液的吸光度和对应反应时间。以同样方法测量2-5 号溶液的吸光度并记录数据。
影响酶促反应速度的因素： 酶的浓度[E] 底物的浓度[S] 溶液的pH值 温度 酶的抑制剂 酶的激活剂
二、实验原理
酶催化剂的特点
1.具有表观活性和专一性所需要的结构空间，反应能在比较 温和的条件下进行； 2.酶促反应的活化能较低； 3.酶的催化效能极高； 4.酶具有高度的专一性。
影响酶作用的因素：酶的浓度、底物浓度、 溶液的pH值、和酶抑制剂等。
米氏方程 [S]、[E]分别为底物浓度和酶的浓度，km为米 氏常数，其物理意义是当酶促反应速度到达 最大速度一半时的底物浓度，单位mol/L
对米氏方程进行双倒数得到：坐标作图，由图得 到截距和斜率，即可计算vmax和Km。
实验注意事项
激活剂及抑制剂对酶活性的影响(修)
激活剂及抑制剂对酶活性的影响酶是一种催化化学反应的生物催化剂。
它可以降低化学反应的活化能，因此可以加速化学反应。
酶在许多生化过程中起着至关重要的作用。
因此，了解酶催化反应的机制以及如何改变酶的活性是非常重要的。
在这篇文章中，我们将讨论激活剂和抑制剂如何影响酶的活性。
激活剂激活剂是一种可以提高酶活性的分子。
它可以通过与酶结合来改变酶的构象，并增强酶的活性。
激活剂通常与酶的活性部位结合，并通过改变酶的构象来影响酶的功能。
激活剂对酶的作用可以是可逆的或不可逆的。
一些激活剂可以增加酶催化反应的速率常数（kcat）。
这意味着，反应的速率可以增加，而反应所需的物质量可以减少。
激活剂可以作用于酶本身或作用于底物。
例如，ATP（三磷酸腺苷）就是一种常见的激活剂，它可以作用于许多酶，并提高它们的活性。
ATP可以通过与酶活性部位结合来影响酶的构象，从而增强酶的催化活性。
抑制剂抑制剂是一种可以减低酶活性的分子。
它可以通过与酶结合来阻碍酶的功能。
抑制剂通常与酶的活性部位结合，并通过改变酶的构象来影响酶的功能。
抑制剂对酶的作用可以是可逆的或不可逆的。
抑制剂可以分为两类：竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。
竞争性抑制剂可以与底物竞争结合酶的活性部位，并阻止底物结合酶。
这可以减慢酶催化反应的速率。
例如，苯丙氨酸羧化酶具有两个基本底物，苯丙氨酸和乙酰辅酶A。
竞争性抑制剂可以与酶的活性部位结合，并阻止苯丙氨酸结合酶，从而减慢反应的速率。
另一方面，非竞争性抑制剂不结合酶的活性部位，而是结合在其他部位上。
这可能会影响酶的构象，从而降低酶的活性。
例如，草酸可以作为异柠檬酸脱氢酶的非竞争性抑制剂。
草酸的结构与该酶的辅酶结合部分相似，因此可以结合在辅酶-酶复合物上，从而降低酶的活性。
激活剂和抑制剂是可以影响酶活性的分子。
激活剂可以通过改变酶的构象来增强酶的催化活性，而抑制剂通过改变酶的构象来减慢酶的催化活性。
竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂是两种不同类型的抑制剂，它们对酶的构象影响是不同的。
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实验安排
6，激活剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。
以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
化学生物学综合实验六
酪氨酸酶抑 制及激活作 用动力学的
分析
• 指导教师：马林 • 化学与化学工程学院
一、实验基本原理
酪氨酸酶(Tyraseosinase ，Tyrase)又称儿茶酚氧 化酶(Ec.1.14.18.1)属于 多酚氧化酶（漆酶和二酚 氧化酶）中的一种。它广 泛存在于红薯、香蕉、苹 果、蘑菇、马铃薯及人体 等动植物中，也存在于微 生物，特别是霉菌之中。
在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。
黑色素形成机制
• 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明，黑色素的 形成主要是由黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶､多巴异 构酶、过氧化物酶、等酶单独或协同作用的结果。
• 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由 酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应： 体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸 即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反 应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟基 吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后与其 它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分 -由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反应中有 半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通过关环､ 脱羧, 最后形成脱黑色素。
1. 实验中，需要细心，要正确使用移液器 2. 一次性比色皿有方向性，使用时要注意 3. 实验结果分析、讨论须有自己的论点
Hale Waihona Puke 二、实验过程酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸 酶）的抑制和激活作用的动 力学。
实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶 （前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、 六羟基二苯甲酮、2萘酚 激活剂：1-萘酚、硫 酸铜、二羟基二苯甲 酮
实验仪器和条件
北京普析通用UV-1901 紫 外可见分光光度计
实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二 酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。
以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
实验安排
5，激活作用的测试 改变样品溶液的剂量，分别
测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
实验安排
3，抑制剂IC50的测试 改变样品溶液的剂量，分别
测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用抑 制百分数(指被抑制而失去活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的抑制活性，作图求出 抑制50%时样品的浓度。
实验安排
4，抑制剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
三、实验报告
采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 1 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几
个点得到比较理想的曲线。
两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行
2
分析，按照研究论文形式写出实验报告。
实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实
3
验结果，如果可能结合起来一起进行分析。
四、实验注意事项
实验安排
1，酶催化条件探索 由于每次实验得到的粗酶
液酶催化活性不同，所以在 测试过程中，需要探索实验 中所使用的酶的剂量。
本实验要求测试的酶催化 活性-每分钟OD值变化在 0.1-0.13范围内。本实验采 用调节酶液用量的方式。
2，测试体系 在总计1000L的测试体 系中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸盐 缓冲液，10L样品溶液（ 以10 L缓冲液或乙醇做 对照），10-20L粗酶液 ，室温放置20分钟，立即 加入50L 25mol/L 邻苯 二酚溶液， 390nm进行 时间扫描，记录1分钟的 OD值。