高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱柱效能的测定
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
敏度10-11g。
二、 高效液相色谱法主要类型及分离原理
根据分离原理，高效液相色谱法分为： 液-液色谱及化学键合相法 液-固色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
反相键合相色谱法
固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、 硅胶一苯基等；
流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛、水和无机 盐的缓冲溶液等。
高效液相色谱图：
数据处理：
甲苯
萘
tR /min
Y1/2 /min
n/
块·m-1
R
n 5.54( tR )2
Y1/ 2
R
tR2 tR1
2 2.35
(Y1/ 2(1)
Y1/
2(2)
)
联苯
天美LC2130 HPLC操作规程
一、开机准备 1.实验室温度应保持在25～30℃之间，湿度小于65%。 2. 根据实验要求，选择合适的色谱柱并安装，准备相
标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择 合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填 状况等因素有关。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
实验一 高效液相色谱柱效能的评价
高效液相色谱柱效能的评定1. 实验目的和要求1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。
1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。
1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。
2. 实验原理苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。
通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。
3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）分析天平3.2 试剂苯、萘、联苯（均为分析纯）甲醇（色谱纯）纯净水4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（80：20，v/v）流速：1mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。
● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。
● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。
● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。
4.3 实验数据处理● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。
根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。
● 柱效计算式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ）●式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ）W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ）5. 问题与讨论2212)(54.5)(16W t W t n R R ==5.1 如何用实验方法判别色谱图上苯、萘、联苯的色谱峰归属？5.2 如何改变色谱条件，可以减小苯、萘、联苯的保留时间？5.3若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改变实验条件以获得改善？。
高效液相色谱分析法
现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。
高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。
2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。
2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。
2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。
高效液相色谱法分离条件的选择
• 4 、固定相颗粒粒度对塔板高度的影响 • 由于A 、Cm和 Csm均随固定相颗粒粒度dp的变小而变小，
而且实验还表明固体相颗粒粒度越小，柱效受流动相线速 度的影响也越小。
• 所以根据速率理论，HPLC的实验条件应该是： ①小粒度、均匀的球形化学键合相； ②低黏度 流动相，流速不宜快； ③柱温适当。
分离含双键的化合物常用氰基键合相分离多基团化合物常用氨基正相键合相色谱的流动相通常采用烷烃加量极性调节剂极性调节剂常从组表183中选见课本390页若还难以达到所需要的分离选择性还可以使用三元或四元溶剂系统
高效液相色谱法分离条件的选择
第六组
• 一、高效液相色谱中的速率理论 • 二、分离条件的选择
一、高效液相色谱中的速率
1、涡流扩散
与气相色谱相同，涡流扩散项也是A=2λdp。一般为了降 低涡流扩散的影响，HPLC中一般使用3～10μm的小颗粒固 定相，为了填充均匀，减少不规则因子，常用球形固定相， 而且要求粒度均匀。此外，HPLC色谱柱以均浆高压填充。
2、纵向扩散
纵向扩散系数Ｂ=2γDm,而Dm与流动相的黏度（η）成 反比，与温度成正比。在HPLC中，流动相是液体，其黏度 比气体黏度大得多，而且常在室温下进行操作，因此组分 在流动相中的扩散系数Dm比气相色谱的要小得多。一般 HPLC的流速在最佳的流速，这时纵向扩散很小可以忽略。
• （二）反相键合相色谱法的分离条件 • 反相键合相色谱法中，常选用非极性键合相，非极性键 合相可用于分离分子型化合物，也可以用于分离离子型或 离子化的化合物。 • 在反相键合相色谱法中，流动相一般极性最强的水 为基础溶剂，加入甲醇、乙氰等极性调节剂。极性调节剂 的性质以及其与水的混合比例对混合溶质的保留值合分离 选择性有显著影响。同时调节流动相的离子强度也能改善 分离效果。例如在流动相中加入0.1%~1%的出酸盐、磷酸 盐等，可减弱固定表面相残余硅醇基的干扰作用，减少峰 的拖尾，改善分离效果。
16高效液相色谱柱柱效测定
高效液相色谱柱柱效测定一、实验目的1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理2．学习高效液相色谱仪的使用3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法二、基本原理高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：式中：t R为组分的保留时间Y1/2为色谱峰的半峰宽度Y为色谱峰的峰底宽度三、仪器和试剂1．仪器1：KLC321型高效液相色谱仪（紫外检测器）2．仪器2：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）3．50μl微量进样器4．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μl/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件1．色谱柱1 长15cm，内径 4.6mm，装填10mm的C-18烷基键合固定相2．色谱柱2.. 长15cm，内径 4.6mm，装填5mm的C-18烷基键合固定相3．流动相甲醇:水（85:15），流量0.8ml/min4．紫外光度检测器波长254nm，灵敏度0.085．进样量 5μl五、实验步骤1．根据实验条件和实验录像指导，按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，色谱工作站之“采样系统”基线平直时，即可进样。
2．吸取5μl苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，并用色谱工作站记录色谱数据，同时记录色谱数据文件名。
3．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
4. 在Agilent 1200仪器上测定色谱柱2的塔板数，打印色谱图并比较色谱柱柱效差异。
六、数据记录及处理1．记录实验条件。
（1）色谱柱与固定相（2）流动相及其流量、柱前压（3）检测器及其灵敏度（4）进样量2．记录色谱峰的保留时间t R和相应色谱峰的半峰宽Y1/2。
3．分别计算苯、萘、联苯在该色谱柱上的理论塔板数n和理论塔板高度。
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高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察
一、实验目的
1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理
2．学习高效液相色谱仪的使用
3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法
4．考察流动相配比对分离情况的影响
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：
2
22/11654.5⎪⎭⎫ ⎝⎛=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间
Y 1/2为色谱峰的半峰宽度
Y 为色谱峰的峰底宽度
影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。
三、仪器和试剂
1．仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器）
2．50μL 微量进样器
3．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。
配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。
四、实验条件
1．色谱柱 长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相
2．流动相 组成1：甲醇:水（95:5）；组成2：甲醇:水（85:15）；流量均为0.8ml/min
3．紫外光度检测器 波长254nm
4．进样量 5μL
五、实验步骤
1．设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。
2．吸取5μL 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。
3．改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。
4．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
六、数据记录及处理
1．记录实验条件。
（1）色谱柱与固定相
（2）流动相及其流量、柱前压
（3）检测器波长
（4）进样量
2．分别记录三个组分色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。
3．分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n ，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。
七、思考题
1．由本实验计算出的各组分理论塔板数说明什么问题？
2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？
3. 试分析流动相条件改变后保留时间及分离度的差异，并阐明原因。