柱效测定以及影响因素
最新影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定
影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定定量分析实验三影响氢焰检测器灵敏度的几个主要因素、氢焰检测器敏感度的测定、色谱柱的柱效的测定【目的要求】1.了解氢气流量、空气流量、载气流量等操作条件对氢焰检测器敏感度的影响。
2.学会测氢焰检测器的敏感度。
【基本原理】【实验条件】1.气相色谱仪2.色谱柱 SE-30 5%不锈钢柱，长2m，内径3mm3.载气 N2，流量：50mL/min4.检测器 FID5.柱温 70℃6.进样口（汽化室）、检测器温度 150℃7.样品：正庚烷、苯、正戊醇，甲醇为溶剂【操作步骤】1．开机①开电源，开载气，调氮气流量到50mL/min，调柱温到70℃，调进样口、检测器温度到150℃。
②按“升温”按钮开始升温。
③调空气流量到500mL/min，氢气流量到75mL/min以上，按“点火”按钮，如果点火成功，会听到一声清脆的爆鸣声，并会看到点火成功的提示（氢气的点火流量应大于最佳工作流量，否则火点不燃，如果空气流量太小，则火也点不燃，则听不到爆鸣声，需重新点火）。
④当柱温及进样口温度达到设定温度后，“Ready”显示亮。
待基线基本稳定后，请按“调零”按钮，将当前的基线电压调到零点。
2．氢气氮气流量比对灵敏度的影响这里氮气流量固定到到50mL/min，改变氢气流量就改变了氢氮流量比。
①选择样品为正庚烷,浓度为10mg/L,进样量为1mL, 范围为1(101),记录灵敏度为8mv/满刻度。
②将氢气流量分别调到15、30、40、50、60、70 mL/min（氢气流量不能太小，太小了会熄火），分别进样，进样的同时按“开始记录”按钮，记录色谱图，色谱峰流出完后，按“停止记录”按钮，计算机会在屏幕上打印出组分的保留时间和峰面积，注意氢气流量的改变对氢焰检测器的灵敏度的影响，将结果输进下表。
氢气流量(ml/min) 15 30 40 50 60 70氮氢流量比 10:3 5:3 5:4 1:1 5:6 5:7峰面积（μvs） 15411 23947 27954 28514 25779 26015 根据刚才的实验数据，灵敏度最高时的氢气流量为:3．空气流量对灵敏度的影响将氢气流量调到刚才摸索出的最佳氢气流量，空气流量调到40、80、160、320、400，500mL/min（空气流量不能太小，太小了会熄火）分别进样，记录色谱图，观察氢气流量的改变对氢焰检测器的灵敏度的影响，将结果输进实验报告（空气流量改变引起峰面积的较明显改变才能说峰面积的改变是空气流量的改变引起的，如果峰面积改变不明显，这种改变可能是随机的，本仿真机也仿真了随机结果，这样才符合实际）。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
如何测定柱效
如何测定色谱柱柱效？
不通的色谱柱有不同的测试方法，来自不同厂家的同类色谱柱也往往采用不同的测试条件，所以最好按照色谱柱说明书中的测试报告测定柱效。
一般工作站的数据处理都有自动计算柱效值的功能，若没有工作站，可由公式计算：
柱效（理论塔板数）等于保留时间与峰宽之比值的平方再乘以16，或保留时间与半峰宽之比值的平方再乘以5.54
测定柱效时，不要接保护柱，同时注意连接的管路尽可能短，以减少死体积。
自己测定的柱效是会低于出厂时测试报告给出的值，因为一般情况下，应用实验室没有专门用于测柱效的仪器。
当然，使用了一段时间的色谱柱的柱效是会下降的。
以下是Waters用于C18(C8)柱效的测定方法：
流动相：乙腈+水＝60+40
流速：1.0 mL/min
检测波长：254 nm
测试样品：2 mL丙酮，0.20 mg苊，溶于100 mL流动相中
进样体积：3.0 L。
柱效测定以及影响因素
柱效测定以及影响因素柱效测定（Column Efficiency Determination）是指在色谱分析中通过柱沉淀试剂的稳定迁移时间与溶质峰宽的比值来评估柱效的一种方法。
柱效是指柱对样品的分离能力，它取决于柱填充剂的形状和物理化学性质，以及流体力学特性和柱床操作参数等一系列因素。
柱效测定可以帮助分析人员评估柱的性能，并确定最佳的柱操作参数，以提高分离效果和增强分析结果的准确性。
影响柱效的因素较多，下面将对其中几个关键因素进行详细说明。
1.柱填充剂：柱的填充剂是决定柱效的关键因素之一、填充剂的表面性质、孔径大小、孔隙度以及孔道分布等特性都会对柱效产生影响。
孔径大小直接影响柱的分离能力，较小的孔径可提供更大的表面积，并且具有更好的分离效果。
孔隙度和孔道分布则决定了样品分子在柱中的扩散速度和传质能力。
因此，选择合适的填充剂是提高柱效的重要步骤。
2.面层润湿性：表面润湿性是表征柱填充剂孔道分布均匀性和表面润湿程度的重要指标。
不同样品的表面润湿性不同，一些样品在柱填充剂的表面上难以均匀分布，导致部分样品分子的扩散速度较快，使得分离能力降低。
因此，在选择填充剂时，要根据不同的液相样品，选择适合的表面润湿性，以提高柱效。
3.柱长度和内径：柱的长度和内径是影响柱效的重要参数之一、柱长度的选择与待分离的成分数目和分离程度有关，理论上，柱越长，分离程度越高。
然而，随着柱长度的增加，分析时间也会增加。
柱内径越小，柱效越高，但是流速也会减小，分析时间会延长。
因此，在实际应用中，需要根据分析要求平衡分离效果和分析时间，选择合适的柱长度和内径。
4.流速和温度：流速和温度是影响柱效的重要操作参数。
流速的选择需要平衡分离效果和分析时间。
流速过高可能会导致溶质在柱中的分离不完全，流速过低则分析时间会较长。
温度的选择与柱的填充剂和待分离的样品有关。
温度的升高可以提高溶质的扩散速度和减小粘度，有利于更好的分离效果。
但同时，温度过高也可能会引起溶解度的变化和柱填充剂的损失，影响柱效。
GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解
GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液： 0.4 M NaCl水溶液样品： 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
大家测柱效的结果只有一个峰）1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数，点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮，可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK，查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键，选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据， plate height（HETP）、Asymmetry 等，点击OK执行。
层析柱效测定方法
层析柱效测定方法层析柱效测定方法（chromatographic column efficiency determination）是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它是基于层析柱内物质的扩散和传质过程进行分析的。
层析柱是一种分离技术装置，由一系列填充物组成。
填充物通常是固体颗粒，具有特定的化学性质，用于分离混合物中的组分。
在层析柱内，混合物通过与填充物的相互作用，使组分分离出来。
层析柱效测定方法通过评估层析柱中物质的传质速率和峰形状，来判断层析柱的性能。
这种方法可以用于评估柱的分离效果、分离能力、分离度等指标，为柱的选择和优化提供依据。
层析柱效测定方法通常基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析。
在柱内，混合物在填充物表面发生吸附，不同组分的吸附速率不同，导致分离。
通过测定柱内物质的扩散速率，可以评估层析柱的分离效果。
层析柱效测定方法可以通过测定柱内物质的保留时间、峰宽、峰高等参数进行分析。
保留时间是指物质从进样口进入柱内到出柱的时间，峰宽是指峰的宽度，峰高是指峰的高度。
这些参数可以通过实验测定，然后根据相关理论模型进行计算和分析。
层析柱效测定方法有多种实验方法和理论模型可供选择。
常用的方法包括质量平衡法、色谱法、逆向色谱法等。
这些方法在实验操作上有所差异，但都可以用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用。
它可以用于分析混合物中的组分，研究物质的分离和纯化，以及评估柱的性能。
同时，层析柱效测定方法还可以用于优化柱的选择和操作条件，提高分离效果和分离能力。
层析柱效测定方法是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。
它基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析，通过测定保留时间、峰宽、峰高等参数来评估柱的性能。
层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用，为分析、研究和优化提供了重要手段。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
气相色谱定性和色谱柱效的测定
实验五 气相色谱定性和色谱柱效的测定一、目的要求1．了解气相色谱仪的基本结构，热导池检测器（TCD ）工作原理及操作技术； 2．认知组分的保留时间、保留体积；3．计算相对保留值、色谱柱的理论塔板数、有效理论塔板数及相邻组分的分离度。
二、实验原理1．色谱法是一种重要的分离分析技术混合物→分离→单组分→检测→定性分析→定量分析 气相色谱：是流动相为气体的色谱。
适于分离分析的对象是气体或容易气化的热稳定性好的物质。
2．基本概念色谱图，色谱峰，基线，峰高h ，峰宽w ，半峰宽w 1/2保留时间t R —从进样开始到色谱峰出现最大值时所需要的时间。
死时间t M —不被固定相保留的组分（空气）的保留时间。
调整保留时间t t t M R R -='保留体积 V R = t R F 相对保留值tt R R ''2112=γ理论塔板数 )()(2154.51622W t Wt R R n ⨯=⨯=有效理论塔板数 )()(21'54.5'1622W t Wt n RR ⨯=⨯=有效分离度定义：相邻两组分的分离度，等于两组分保留时间之差与峰宽之和一半的比值。
W W t t R R R 21)(212+-=3．热导池检测器（TCD ）结构及工作原理 热导池 热敏元件（钨丝） 惠斯登电桥线路利用被测组分气体与载气的热导系数不同的原理实现检测。
4．色谱定性依据：在一定色谱条件下，每一种物质都有一个确定的保留值和它相对应。
还可以用试样加入纯物质增加峰高法定性。
相对保留值法定性较好。
三、实验条件1．SP-6800A 型气相色谱仪，热导池检测器（TCD ）;2．不锈钢填充柱：1米长，内径3毫米，内装GDX-103 (80～100目)； 3．1微升微量进样器，氢气（钢瓶或氢气发生器），皂膜流量计。
4．试剂：纯净水，无水乙醇，乙酸乙酯，混合试样。
5．仪器条件：载气（H 2）输入压力0.25MPa 柱前压0.06 MPa汽化室（INJ）温度170℃，检测室（AUX）温度170℃，色谱柱室（OVEN）温度160℃，桥电流150mA, 衰减001。
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主要参数（下表）。
颗粒大小（μm） 15 30 35
50 75-100
200
介质实例 SOURCE™ 15
SOURCE 30
Sepharose High Performance, Superdex™ Sephacryl™
Sepharose Fast Flow, Capto™, MabSelect™
Sepharose Big Beads
在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的
峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。允许标准
h≤ 3 保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效。颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的
Sepharose Fast Flow,
Sepharose XL， Capto™, MabSelect™
N/m ~20000 ~11000 〉10000 〉10000 ~9000 ~3000
As 0.8~1.5 0.8~1.5 0.8~1.8 0.7~1.3 0.8~1.5 0.8~1.5
0.8~1.6
、
柱效测定主要影响因素：
1.柱效测定使用的检测物
检测物的选择需要保证物质大小（分子量）能完全渗透迚入层析介质的孔隙结构内。必须避免检测物与层
析介质发生表面相互作用，以保证检测物是化学惰性和稳定的。此外，洗脱成分和样品的粘度和密度差异应降低至
最小，以避免由不稳定流动模式（粘度指纹效应）造成的系统误差。通常使用的，能符合这些要求的样品/洗脱系
当使用 NaCl 作为检测物时，洗脱液中至少要用 0.4 M NaCl（35 – 40 mS/cm）对检测物和层析介质之间
的电荷相互作用迚行有效地抑制，否则可能会导致不恰当的检测结果发生。如果发生相互作用时，峰对称性受到破
坏。
2.液体流速
、
峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效
柱效在很大程度上
取决于检测过程中所使用的液体流速。理论上，
停留时间（停留体积）
折合的塔板高度
h=HETP/d/P
对称性 As
**达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对
应的停留时间（停留体积）。
相对峰宽通常用理论塔板（N），理论塔板 数（HETP）或折合为塔板高度（h）来迚行 描述：
() σ
σ ()
对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏 差，通过对 10%峰高处的峰宽迚行计算得到：
统为水-丙酮和盐系统，这些系统可分别通过测定吸收值和电导迚行监测。根据层析介质的化学属性，推荐以下样
品和洗脱液：
介质 除疏水合成聚合物， RPC 和 HIC 介质以外 的所有介质 RPC 和 HIC
所有介质
洗脱液 水
样品 1 -2% 丙酮水溶液
20%乙醇
1 -2%丙酮，至少 20%
的乙醇
0.4 M NaCl（溶于水） 0.8 M NaCl（溶于水）
峰展宽和液体流速
之间的关系可通过范德姆特方程迚行描述： B
+ +C×μ μ
其中 A 指的是湍流扩散；B 指的是分子
扩散；C 指的是传
质阻力；u 指的是液体流速（cm/h）
右图实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影响。当液体流速在 20 cm/h 左右时折合塔板高度最小且柱
性能最大。当速度降低时，由于范德姆特方程中 B 对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。在高检测速度时，由于
4.检测系统的滞留体积（系统死体积体之间）和下游体积（从
柱底到检测器）之和。与扩大样品体积的效果类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱效柱效。因此用于
、
检测的管路应尽可能的短，并且内径应最小且不会造成过大压降。 作为一个普遍的经验法则，一个生物过程层析使用的典型层析柱的柱效检测应保证外体积小于柱体积的 5%，
柱效测定以及影响因素
柱效（column efficiency ）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决 定的分离效能。通常用理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示。 柱效 是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。
示踪物质浓度
半峰高峰宽 Wh 时间（洗脱体积 V）
如想获得最佳柱效则需使外体积小于 3%。在测定柱效前最好测定系统外体积。此外，还需要对柱效检测中的保留 体积迚行记录，以便和填充床以及柱本身的标称保留体积迚行比较。若保留体积进大于预期，则提示检测物和层析 介质之间可能存在相互作用，以及柱外检测系统存在滞留体积。当检测设置一经确立，层析柱安装完毕，需要迚行 连续三次检测以确认该方法的可重复性。
的是以柱宽而言，柱效越低通常意味着峰对称性越好。或者以 N/m（每米的理论塔板）来表示，对于不同颗粒大小
的填料，达到以下的数值，即可认为柱效比较好：
颗粒大小（μm） 15 30 34
50 75-100
介质实例 SOURCE™ 15
SOURCE 30
Sepharose High Performance, Superdex™，Superose Sephacryl™
术语 塔板数 平均停留时间* 方差*
2
停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 理论塔板数
N μ1
σ
tR VR Wh
L d/P HETP
最佳柱效
对于生物过程色谱中使用的有孔介质，其最佳柱效时实验测定的塔板高度 h 小于等于 3。就峰的对称性而
言，理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度 h ≤ 3 时，一般能接受的范围通常在 0.8-1.8 之间。需要谨记
速度（cm/h） 60 60 30
20 20
10
3.样品体积 柱效柱效测试通常使用的样品体积为 1%的柱体积（Vc）。当某些硬件条件无法满足时，可以在经验范围内
迚行微小优化以加强对示踪物质的检测能力。然而，值得一提的是，对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导 致色谱峰明显加宽，降低塔板数,这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。由于峰宽增大，峰对称性可能有 所改善。这一点与增加检测流速的效果类似。