高效液相色谱法测定维生素C
HPLC测定维生素C
实验一HPLC测定水果中维生素C一、实验目的（1）掌握高效液相色谱法的原理。
（2）掌握高效液相色谱仪的操作。
（3）应用标准曲线法测定物质含量。
二、实验原理以C18键和反向柱为固定相，乙腈-0.05mol/L醋酸钠溶液为流动相，在216nm的波长下根据保留时间和峰面积进行定性定量分析维生素C。
三、试验方法（1）色谱条件Water515型高效液相色谱仪色谱柱：C18，25cm×0.46cm，0.5μm流动相：0.05mol/lNaAc:乙腈=95:5 流速：0.6ml/min紫外检测器，波长：256nm 进样量：20μL（2）维生素C的提取：准确称取一定量的水果（约15g），放入食品粉碎机中，加少许水，打成匀浆，然后全部转移到100ml容量瓶中，在超声波震荡15min。
用0.45μm膜过滤，稀释10倍后待测。
（3）标准样品的配置准确称取100mgVc，溶解在100ml容量瓶中并定容，得到1mg/ml 的Vc溶液，稀释100倍配成浓度为10μg/ml的标准液为储备液。
然后分别称取2、4、6、8、10ml储备液至10ml容量瓶中，并定容，配制浓度为2、4、6、8、10μg/ml的标准溶液。
（4）开机平衡，打开稳压电源，打开泵、检测器、电脑电源，打开色谱工作站，设置流动相流速，检测器波长。
放上配制好的流动相，打开泵，平衡色谱柱。
到基线基本走平为止。
（5）样品测定：首先依次测定不同浓度的标准品（浓度从小到大），制作标准曲线。
再进样分析待测样品。
四、实验记录水果质量m水果= 标准Vc质量m Vc=外标峰面积法：以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。
由工作曲线查出样品组分含量（1）思考题使用紫外检测器时为什么选择最大吸收波长？答：选择最大吸收波长，被测组分的灵敏度最高.吸光度最大的峰值附近斜率要比其他的区域要小，波长偏差Δλ对应的吸光度偏差ΔA当然也比别的区域要小，减小实验误差。
（2）如是测定单组分含量（没有其他杂质存在），改变那些条件可以缩短实验时间？答：更换短的色谱柱，增加有机相比例，提高流速，提高柱温箱温度；缩短进样阀与检测器之间的管路。
维生素c检测方法
维生素c检测方法
维生素C的检测方法包括化学法、色谱法和光谱法等。
以下是常用的几种检测方法：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：这是最常用的维生素C检测方法之一。
它使用高效液相色谱仪来分离和测定维生素C。
样品先经过样品前处理（如提取或衍生化），然后通过HPLC进行分离，并使用紫外或荧光检测器进行定量测定。
2. 红牛氏法：这是一种化学滴定法，使用二氧化碳（红牛氏溶液）和碘化钾作为滴定剂，通过滴定柠檬酸钠或番茄酱来测定维生素C的含量。
维生素C的含量与滴定所需的体积成正比。
3. 荧光光谱法：维生素C具有明显的荧光特征，可以通过测量样品的荧光强度来定量测定维生素C的含量。
荧光光谱法可以用于水溶液、血浆等样品的测定。
4. 比色法：利用维生素C与酸性溶液中的二氧化锰反应生成亚铁离子，再与柠檬酸反应生成琥珀色化合物，通过测量化合物的吸光度来测定维生素C的含量。
这些检测方法各有优缺点，选择合适的方法取决于需要测定的样品类型、所需灵敏度和检测成本等因素。
高效液相色谱法测定化妆品中的维生素C及其衍生物
高效液相色谱法测定化妆品中的维生素C及其衍生物摘要：维生素C(VC)，又称L-抗坏血酸，是一种天然抗氧化剂，抑制皮肤中酪氨酸酶活性，阻断黑色素生成，达到美白效果。
维生素C虽然活性高，但在溶液中不稳定，容易受到光、热、氧等因素的破坏，失去还原能力，限制了其在化妆品中的有效利用率。
关键词：高效液相色谱；维生素Ｃ；抗坏血酸葡糖苷；抗坏血酸磷酸酯镁；抗坏血酸乙基醚；一、样品处理1. 水易分散的样品。
适合化妆水、水乳液等含油脂较少的样品。
准确称取约 0. 500 ｇ样品于 50 ｍＬ具塞比色管中，加入 30 ｍＬ 0. 02 ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液（ｐＨ 3. 0），涡旋混合 2 ｍｉｎ，转移至 50 ｍＬ容量瓶中，用 0. 02ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液（ｐＨ 3. 0）定容至刻度。
混匀后取 10 ｍＬ溶液于 15 ｍＬ离心管中，在10 ℃、12 000 ｒ／ｍｉｎ条件下离心 10 ｍｉｎ，上清液过0. 22μｍ滤膜，滤液待测。
2. 水不易分散的样品。
适合面膏等含油脂较高及凝胶类、啫喱类样品。
准确称取约 0. 250 ｇ样品于 50 ｍＬ具塞比色管中，加入 1. 0 ｍＬ二氯甲烷，涡旋混合至样品均匀分散后，准确加入 25 ｍＬ 0. 02 ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液（ｐＨ 3. 0），涡旋混合 2 ｍｉｎ。
混匀后取 10 ｍＬ溶液于15 ｍＬ离心管中，在10 ℃、12 000 ｒ／ｍｉｎ条件下离心 10 ｍｉｎ，上清液过0. 22 μｍ滤膜，滤液待测。
被测物含量超过标准曲线的线性范围时可取适量试样滤液用提取溶剂稀释后再测定。
二、样品前处理条件的优化维生素Ｃ和抗坏血酸磷酸酯镁易溶于水，抗坏血酸葡糖苷和抗坏血酸乙基醚是亲油亲水两性物质；维生素Ｃ在碱性和中性条件下不稳定，因此考虑采用酸性溶液作为提取溶剂。
化妆品基本上分为不需要乳化的液体类及需要乳化的膏霜类两大类。
前者含水量高，在水溶剂中容易分散形成均匀体系；后者含有一定的油脂，密度较高，在水溶液中不易分散。
高效液相色谱法测定果珍中维生素C含量_金黎明
高效液相色谱法测定果珍中维生素C 含量 金黎明 姜 波 郝 苗 (大连民族学院生命科学学院,大连 116600) (大连市产品质量监督检验所,大连 116021) 摘要 用0.1%的草酸作为流动相,高效液相色谱法测定了果珍中维生素C 的含量。
维生素C 的浓度c 在0～300μg /m L 范围内与色谱峰面积A 呈正比关系,线性相关系数为0.9993。
方法的回收率为96.2%～103.2%,测定结果的相对标准偏差为0.6%(n =8)。
利用高效液相色谱法测定果珍中的维生素C 的含量,具有试剂用量少、操作简单、结果准确等特点,采用弱酸性的草酸为流动相,避免了维生素C 的分解。
关键词 维生素C 果珍 高效液相色谱 维生素C 是一种水溶性维生素,又被称为抗坏血酸,它是维持人体正常生理代谢的一种重要化合物,若严重缺乏会引起坏血病,维生素C 还可参与体内氧化还原反应,具有解毒作用。
近年的研究表明,维生素C 可预防癌症,具有抗氧化、抗衰老的作用,并对肝炎、肝硬化有疗效。
但是人体自身不能合成维生素C ,必须由食物中摄取,维生素C 广泛存在于新鲜水果、蔬菜中[1]。
维生素C 测定的方法一般有碘量法[2]、比色法[3]、荧光法[4]等,这些方法操作繁琐,近年来普遍采用高效液相色谱法测定维生素C[5,6]。
笔者利用高效液相色谱法,通过采用低浓度的草酸流动相,分析了果珍中的维生素C 含量,本方法所用试剂较少,操作简单,且通过采用弱酸性的草酸流动相,避免了维生素C 的分解,测定结果较为理想。
1 实验部分1.1 主要仪器与试剂 高效液相色谱仪:L C-10A 型,日本岛津公司; 二极管阵列检测器:S P D-M 10A 型,日本岛津公司; 高压输液泵:L C -10A 型,日本岛津公司; 自动进样器:S I L -10A 型,日本岛津公司; 维生素C 标准对照品:维生素C 含量99.7%。
中国医药上海化学试剂公司; 草酸:分析纯,沈阳医药有限公司; 甲醇:H P L C 级,使用前经0.45μm 滤膜过滤,美国T c d i a 公司; 草酸溶液:0.1%。
用反相高效液相色谱法测定食物、药物和生理体液中的维生素C※
表 ２
结 果 和讨 论 （ 一）流动相的ｐ Ｈ和离子强度对Ｖ 峰 ｃ 的Ｋ 值和峰形的影响 ＇
为了使 Ｖ 在色谱上有适当的保留值， ｃ 分别以 不同ｐ 和不同浓度的 Ｎ ４ ２Ｏ 为 Ｈ ＨＨＰ ４
流动相，测定了 Ｖ ｃ峰的Ｋ值，结果见表 ２ ＇
荧光法［ ］ １ 和紫外法［ 。 本文报道了用反相 ０ ３ ］ ＨＰ Ｃ分离，紫外检 测 器 检 测，测定了食 Ｌ 物、药物和生理体液 中 的 Ｖ 。并对流动相 ｃ 的ｐ Ｈ值和离子强度作了探讨，对前人报道 的各种 Ｖ ｃ提取剂进行了筛选。 实 验 部 分
摇匀，其它处理同上。 药物：取数片 （ 粒）Ｖ ， 准确称重后， ｃ 研磨。以下处理同标准 Ｖ ｃ溶液的配制。即 准确称取 ２０ ｍ Ｖ ，用３ ５０ ｇ ｃ ％ＨＰ ３ Ｏ 分级稀释
３６ １ ５ ． ９８
［ ］ Ｅ Ｋ ｅ ，． ｈ ｍ ｔ ｒ １， ３ １ ５． ７ ． ｕｒ ＪＣ ｒ ａ ｇ， ９２７（ ６） ａ ｏ ｏ． ９ ［ ］ Ｍ Ｋ ｂ ， ｏｅ ．Ｃｅ ．Ｃ ｍ ｕｉ ０ ８ ． ｕｉ Ｃｌｃ ｚ ｈ ｏ ｍ ｎ． ， ｎ ｌｔ ｃ ｔ ，３
１０（９５． １４ １６ ）
ｏ ｔｅ ｓ ｍｏ ｅｔ ｔｅ ｏｄ ｄ ｅ ｒ ｃｎ ｆ ｆ ｔ ｍ ｎ， ｈ ｓｃｎ ａ ｔ ｔｉ ｅ－ ｈ ｉ ｒ ｅ ｎ ｈ ｈ ｄ
［３ Ｓ ． ｈｎ Ｓ ． ｅｇＰｏｅ ｉｇｏＳ ｏ １ ． Ｃ ｅ，． Ｐｎ， ｒ ｅ ｎｓ ｉ － ］ Ｙ Ｙ “ ｃｄ ｆ ｎ
Ｗｅ Ｇ ｒ ａ Ｓｍ ｏｉ ｏ Ｃ ｒｍ ｔ － ｓ ｅ ｎ ｐｓ ｍ ｎ ｈｏ ａ ｇ ｔ ｍ ｙ ｕ ｏ
维生素C含量的测定(高效液相色谱法)
维生素C含量的测定(高效液相色谱法)1．原理试样中的抗坏血酸用溶解超声提取后，以离子对试剂为流淌相，经反相色谱柱分别，其中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸挺直用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245nm)测定；试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液举行还原后，用紫外检测器(波长245nm)测定L(+)-抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量。
以色谱峰的保留时光定性，外标法定量。
2．试剂与设备 (1)试剂偏磷酸(HPO3)n：含量(以HPO3计)≥38% ,(Na3PO4·12H2O),(KH2PO4) ,(H3PO4) ; 85%, (C3H7NO2S)：优级纯，(C19H42BrN)：色谱纯，(CH3OH)：色谱纯。
(2)试剂配制偏磷酸溶液(200g/L)：称取2008(精确至0.1g)偏磷酸，溶于水并稀释至1L，此溶液于4℃的环境下可保存一个月；偏磷酸溶液(20g/L)：量取50mL 200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL; 溶液(100g/L)：称取100g(精确至0.1g)，溶于水并稀释至1L, 溶液(40g/L)：称取4g ，溶于水并稀释至100mL，临用时配制。
(3)标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6)：纯度≥99%, D(+)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C6H8O6)：纯度≥99%。
(4)标准溶液配制L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL)：精确称取L(+)-抗坏血酸标准品0.0lg(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。
该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。
D(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL )：精确称取D(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。
该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。
高效液相色谱法测定食品和饮料中维生素C含量
中维 生 素 Ｃ含 量 的 方法 ， 现报 道 如 下 。
１ 研 究 资料
２２ 准确度试验 ．
本 试 验 采 用 猕猴 桃 为本 底 试 样 ， 均含 量 平
为 ０ ２ ２ ％ ， 了低 、 、 ３个 浓 度 的 加 标 回 收 ， 个 浓 度 ．５ ４ 做 中 高 每 各 做 ３个 。 回收 率 范 围 为 ９ ． ％ ～１ ２ ， 表 １ ９３ ０％ 见 。 表 １ 准 确度 实验
Ａ．维 生 素 Ｃ对 照 品 ； ．猕 猴 桃 样 品 ； Ｂ Ｃ．浓 缩 果 汁 ； ：维 生素 Ｃ １ 图 １ 维 生 素 Ｃ标 准 品 和样 品 色 谱 图
的试 样 ， 溶 液 颜 色 背 景 干 扰 大 ， 最 终数 据 有 影 响 。高 效 液 其 对 相 色 谱 法 具 有 高 效 、 速 、 定 、 敏 度 高 的特 点 ， 在 较 短 时 快 稳 灵 能 间 内完 成 测 定 ， 者 探 讨 了高 效 液 相 色 谱 法 测 定 食 品 及 饮 料 笔
法 ｌ 等 ， 是维 生 素 Ｃ具 有 较 强 的 还 原 性 ， 中性 和 碱 性 环 ２ 但 在
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境 下 不稳 定 ， 热 迅 速 分 解 ， 测 方 法 操 作 步 骤 复 杂 ， 有 试 遇 检 具
高效液相色谱法测维生素c原理
高效液相色谱法测维生素c原理宝子们，今天咱们来唠唠高效液相色谱法测维生素C的原理，可有趣啦。
咱先得知道维生素C是个啥。
维生素C呀，那可是个对咱们身体超重要的小机灵鬼呢。
它在好多身体的机能里都起着关键作用，像让咱皮肤变好啦，增强免疫力啦之类的。
在食物里也到处都有它的身影，水果里、蔬菜里，它就像个小小的健康守护者。
那高效液相色谱法又是个啥神奇的东西呢？想象一下啊，它就像是一个超级精密的分拣小能手。
这个方法里有个很重要的部分就是流动相和固定相。
固定相就像是一个个小房子，安安静静地待在那里，而流动相呢，就像是一群勤劳的小快递员，带着要检测的东西跑来跑去。
对于维生素C的检测啊，样品被制备好之后，就被流动相带着在这个系统里溜达。
维生素C这个小不点就开始了它的奇妙之旅。
当它在流动相的带领下经过固定相的时候，就会发生一些很有趣的互动。
因为维生素C它有自己独特的化学结构呀。
这个化学结构就决定了它和固定相、流动相之间的相处模式。
就好比每个人都有自己独特的性格，维生素C也有它自己独特的“性格”来决定它在这个系统里的行为。
在这个过程中，不同的物质，因为它们的化学结构不一样，在固定相和流动相之间的分配比例就不一样。
这就像是不同的小朋友在玩游戏的时候，有的喜欢在这个角落，有的喜欢在那个角落。
维生素C呢，就会按照它自己的规律，在固定相和流动相之间跑来跑去，这个过程就会产生一个时间差。
然后呢，仪器就会很聪明地检测到这个时间差。
这个时间差就像是维生素C的一个小标签，告诉我们，“我就是维生素C”。
而且啊，根据这个时间差的长短，还能知道这个维生素C的含量呢。
如果含量高，那它在这个系统里的表现就会更明显，就好像一群人里，人多的那一组就更引人注目一样。
这个高效液相色谱法测维生素C啊，还有个很厉害的地方。
它超级精确呢。
就像拿一个超级精细的小尺子去量东西一样。
一点点小小的维生素C它都能发现。
不像咱们有时候凭感觉去判断一个东西有没有维生素C，这个方法可是科学又准确的。
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高效液相色谱法测定维生素C的含量
【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。
本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。
【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量
1、引言
维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。
Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。
人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。
同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。
Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。
樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。
溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。
HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。
其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。
有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。
制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。
2、HPLC测定维生素C的含量
2.1、仪器试剂
2.1.1、仪器
高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 µm)；平头进样器。
2.1.2、试剂
乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。
Vc 标准溶液：快速准确称取 0.025 g Vc，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，得到 100 mg/L 标准溶液备用，现用现配。
2.1.3、色谱条件
流动相： 3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4水溶液（v/v）；流速 1 mL/min；柱温 30℃，紫外检测波长 265 nm；进样量10 µL。
2.2、实验步骤
2.2.1、样品处理
1、按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。
2、样品准备：取 10 片维生素 C 片，研匀。
准确称取 0.02g，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 50 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，用0.45µm滤膜过滤。
3、标准曲线绘制：分别配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定 3 次。
以 Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。
4、定量分析：供试品溶液经0.45 µm 微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析。
平行测定 2 次，记录其 Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算维生素片中 Vc 的含量。
5、实验结束后，按要求清理好仪器。
3、数据处理
不同Vc 浓度对应色谱峰面积图表
y=30.58x-14.146 R2=1
y(sample)=1892.33813
代入上式有x=62.34mg/L
4、实验结果讨论
本实验中所采用的定量分析方法为外标法，即标准校正法。
该法直接，易于操作，计算简单。
但是标样与测定组分为统一化合物，分离、检测条件的稳定性对定量结果影响较大。
除此方法外，常用的定量分析方法还有内标法、峰面积归一化法。
至于定性分析，常用的方法为保留值定性，与已知物对照定性，还有安保柳枝经验规律定性。
此外还有选择性检测响应定性，色谱-结构分析仪器联用等方法。
在分析未知物时，首先要知道这个化合物化学物理常数，然后选择合适的样品处理方法，使样品有较好的萃提回收率和较少的干扰成分存在；而对于分离分析，如果使用紫外检测器，在这之前应先做个化合物的吸收波长扫描，以找出其最大吸收波长，流动相先用纯水和乙腈或甲醇在不同比例时进行调节，保证出峰时无干扰和一定的分离度，然后依据峰形和化合物的pKa值进行水相的pH值调节，以找到最佳的流动相体系。
气相色谱仪具有分离选择性好、柱效高、速度快、检测灵敏度高、试样用量少、应用广泛等特点。
但气相色谱仪也具有一点局限性，在没有纯标样的条件下，对试样中未知物的定性定量较为困难，往往需要与红外光谱、质谱等结构分析仪器联用，对于飞沸点高、热稳定性差、腐蚀性和反应活性强的物质，气相色谱仪分析比较困难。
高效液相色谱法与气象色谱法相似，具有高速、高效、高选择性、高灵敏度的特点，但仪器设备相对复杂，成本较高。
高效液相色谱法尚缺少灵敏度高的通用型检测器，而且使用有机溶剂作为流动相容易污染环境，梯度洗脱操作复杂。