抗药抗体检测的验证实验问题
药物的免疫原性分析方法浅析
药物的免疫原性分析方法浅析摘要：药物的免疫原性评价是临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的抗体反应会影响药动学、药效或毒性反应。
ADA的产生会缩短或延长药物半衰期，改变药物在体内的生物分布。
免疫原性的分析在复杂的血清基质中进行，涉及到多学科多领域。
分析方法及检测水平也存在不一致的情况，需要规范实验操作，提高检测的有效性。
免疫原性评价是药物开发阶段中安全与疗效评价的需要，也是申报提交的关键要素。
开发有效的免疫原性检测方法意义重大。
关键词：免疫原性，MRD，方法学验证正文免疫原性通常是指治疗性蛋白和/或代谢物诱发其自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。
一般分子量越大免疫反应越强。
分子量低于4000时一般不具有免疫原性，在4000到10000之间时具有弱免疫原性，分子量大于10000时具有强免疫原性。
但是也有例外要根据物质的结构决定。
免疫原性分析必须在临床前和临床阶段均开展。
具有免疫原性的物质可能诱发机体产生有害的免疫反应，甚至威胁生命。
免疫原性评价需要有效特异的检测方法。
在临床前便需要确定检测方式，在方法的设计、开发和验证中需要严格控制各环节。
临床前和临床中样本的检测需使用经过严格验证的方法进行检验。
目前应用较广泛的是平台主要包括ELISA、ECL、RIA和SPR。
检测方法一般为夹心法、间接法或直接法。
免疫原性方法学的开发要考虑多种因素，主要包括反应模式的选择、包被抗原浓度的选择、包被条件的选择、封闭条件的选择、样品稀释液的选择、最小稀释度（MRD）的选择、酶稀释液的选择、显色液时间的选择以及各条件的孵育时间及温度的选择。
每个反应步骤都会影响方法的性能。
阳性抗体的质量直接影响方法的灵敏度。
阳性抗体需要稀释在与待检样本一致的空白动物血清中。
由于基质的复杂性，在很大程度上会增加检测背景，需要优化各反应条件将背景降低。
对于背景的高低无确定的要求，但是背景越低越好，太高的背景也会影响检测灵敏度。
开发过程中要优先考虑灵敏度和耐药性，其次为精密度、选择性、特异性、稳定性。
做实验不出结果总么破！科研抗体选对了么？
做实验不出结果总么破！科研抗体选对了么？科研工作离不开抗体，WB、IP、IHC、IF、ChIP和FC都需要用到抗体，那么这几种实验方法中的抗体有什么区别呢？实验做不出来，您的抗体选对了么？一、关于特异性的选择特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。
1蛋白特异性针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分：a.重组蛋白如果不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。
b.内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。
c.磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。
2种属特异性同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。
a.目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性的情况与其他种属发生交叉反应。
需要参照说明书注明的可反应种属信息。
b.一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。
3实验方法特异性目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。
4标记物的特异性一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如WB、IHC 等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。
但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。
那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数要求选择对应的标记物。
在免疫荧光双标实验中，需要选配不同的荧光标记物。
二、不同实验对抗体有什么不同的要求？在理解上面技术对抗体需求的区别之前我们首先要知道这些实验技术都需要什么样的抗体。
如何进行抗药抗体ada检测？最佳实践分享
如何进行抗药抗体ada检测？最佳实践分享一、什么是抗药抗体ada？抗药抗体ada（Anti-Drug Antibody）是指人体免疫系统产生的抗体，针对外源性药物（如生物药物）进行免疫反应。
这些抗体可能会影响药物的疗效和安全性，因此对抗药抗体ada进行检测至关重要。
图1。
二、为什么需要进行抗药抗体ada检测？抗药抗体ada的产生可能会导致多种问题，包括但不限于：1.药物疗效下降：抗药抗体ada与药物结合，形成药物-抗体复合物，从而降低药物在体内的有效浓度，减少药物对疾病的治疗效果。
2.免疫反应：抗药抗体ada的产生可能引发免疫反应，导致过敏反应、炎症等不良事件。
3.药物清除加速：抗药抗体ada与药物结合后，可能促进药物的清除，缩短药物在体内的半衰期，降低药物的持续时间和疗效。
因此，及早进行抗药抗体ada检测，可以帮助医生评估患者对药物的免疫反应情况，调整治疗方案，提高治疗效果和安全性。
三、抗药抗体ada检测的方法目前，常用的抗药抗体ada检测方法主要包括以下几种：1.血清学方法。
血清学方法是最常用的抗药抗体ada检测方法之一。
该方法通过采集患者的血液样本，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术，检测血清中是否存在抗药抗体ada。
这种方法操作简单、成本较低，适用于大规模筛查。
2.细胞学方法。
细胞学方法是一种更为精确的抗药抗体ada检测方法。
该方法利用细胞培养技术，将患者的血液样本与药物结合，观察是否出现细胞毒性反应。
这种方法能够检测到抗药抗体ada的中和活性，对于评估药物的免疫原性和疗效影响更为准确。
3.功能性方法。
功能性方法是一种较为复杂的抗药抗体ada检测方法。
该方法通过评估抗药抗体ada对药物功能的影响，如药物结合能力、中和活性等，来判断抗药抗体ada对药物疗效的影响程度。
这种方法需要较高的实验技术和设备支持，适用于对药物疗效影响进行深入研究的情况。
四、抗药抗体ada检测的最佳实践分享在进行抗药抗体ada检测时，以下几点是需要注意的最佳实践：1.选择合适的检测方法。
抗体亚型鉴定常见问题解析
抗体亚型鉴定常见问题解析一、单抗亚型鉴定(亚型,单抗,腹水,阳性克隆)筛选出阳性克隆后，制备了腹水，可是鉴定亚型的时候，发现亚型不纯，有好几种，不知道是什么原因。
亚型鉴定选用的是SBA的亚型分选试剂盒。
腹水没有纯化，离心后直接测得。
请大家帮我分析一下是什么原因？答：你要测亚型必须用细胞培养上清或者是纯化后的抗体，绝对不能用腹水：腹水的成分很杂，包含小鼠本身的IgG。
另外还有可能是你的细胞株本身就不是单克隆，SBA的亚型试剂盒我没有用过，我用过sigma的是ELisa方法测定亚型，很不好用。
用serotec试纸条或bethly免疫扩散效果很好；HBT的试纸条也不错，操作简单，2-3小时搞定，推荐用细胞上清来检测，不易出现多亚型误检。
缺点是价格偏高；谢谢了。
从大家的分析来看亚型不纯由以下原因产生：1.腹水需要纯化后再测亚型。
2.单克隆筛选不纯。
二、单抗亚型鉴定为何全部是IgM在小鼠免疫阶段，是按照经典方法进行免疫的：经过基础免疫，三次加强免疫（间隔三周），小鼠效价达到1：12800以上，末次冲击免疫三天后，取脾细胞与SP2/0细胞融合，然后根据间接ELISA检测效价上清结果和有限稀释法进行筛选和亚克隆，其中的酶标二抗用的是辣根酶标记的羊抗鼠IgG（Fc片段），三轮亚克隆后得到五铢全阳株，可是经过取他们的细胞上清进行亚型鉴定结果全是IgM。
并且最近师兄们做的其他抗原筛选到的单抗，经过腹水鉴定也全是IgM。
不知道原因何在。
请院子里的战友指点迷津：1.在制备单抗过程中，如何能最大限度的制得IgG型单抗，影响其为IgM的因素都有哪些？？如果说免疫方法和筛选阶段所用的酶标二抗有最大影响的话：我上面的免疫程序和用的酶标二抗都是朝着IgG而设计的。
2.在进行亚型鉴定过程中，在对单抗株细胞上清进行浓缩的时候，会不会也将细胞上清中的小牛血清也进行了同等的浓缩，10% 的小牛血清和1～5mg/L的单抗浓度相比，在鉴定亚型过程中有没有可能只是鉴定出来了小牛血清中的各种抗体亚型？？3.能否请有志之士给出亚型鉴定两种方法（ELISA和免疫双扩）的详细步骤（经过实践证明了得，可行的）？？例如：在免疫双扩的时候上清中抗体浓度应该在什么范围之内？？而腹水浓度又应该设在什么范围之内？？4.请大家给推荐几个性价比高的鉴定亚型的试剂盒。
抗o实验过程注意事项
抗o实验过程注意事项抗O实验是一个非常重要的实验，对于研究新药的效果和安全性起着至关重要的作用。
为确保实验的顺利进行和取得准确、可靠的结果，进行该实验时需要注意以下几个方面的事项：1. 实验前的准备在进行抗O实验之前，需要充分准备以确保实验的顺利进行。
首先应该对实验所需的材料和设备进行检查和准备，确保其完整性和正常运作。
同时，还需要充分了解所用药物的性质和用法，并进行充分的文献研究和前期实验，以了解其适应症、剂量和可能的副作用等信息。
2. 实验对象的选择实验对象的选择是实验中的一个重要环节。
在进行抗O实验时，应该选择与目标疾病相符的模型动物，以确保实验结果的可靠性和代表性。
同时，还应该考虑到实验对象的年龄、性别和体重等因素对实验结果的影响，尽量保持实验对象之间的一致性。
3. 实验条件的控制为了得到准确可靠的实验结果，实验条件的控制非常重要。
在进行抗O实验时，应该严格控制实验环境的温度、湿度和光照等因素，以减小这些因素对实验结果的可能影响。
此外，在实验过程中还要注意避免可能的交叉感染，确保实验对象的健康和受试者的安全。
4. 实验过程的监测在进行抗O实验时，需要进行实验过程的监测和记录。
在实验过程中，需要对实验对象的相关指标进行定期检测和记录，以观察药物的疗效和安全性。
同时，还需要密切观察实验对象的行为和生理表现，及时发现异常情况并采取相应措施。
5. 实验数据的统计和分析实验结束后，需要对实验数据进行统计和分析。
通过对数据的分析，可以对药物的疗效和安全性进行客观评估，并提供科学依据和指导给后续的研究和临床应用。
在进行数据分析时，应该采用合适的统计方法，并进行严格的数据校验和结果验证，以确保实验结果的严谨性和可靠性。
在进行抗O实验时，除了以上的注意事项，还应该注意实验的伦理和法规问题，遵守科学道德规范，确保实验的合法合规性和符合道德准则。
此外，还需要与团队成员和相关研究人员进行充分的沟通和协作，共同努力实现实验目标。
抗药抗体检测的验证实验问题
Identify & exclude analytical outliers (AO) from each assay run/plate separately. Iterate until no more AO
Then identify & exclude biological outliers (BO) by evaluating the distribution of subject averaged data. Iterate until no more BO.
S/N ratio is obtained for each sample in each run Logarithmic transformation applied to all SN values Detect and removal of analytical outliers (Grubbs’ test) Eliminate and delete biological outliers by Boxplot method with 3IQR Normality test (Shapiro-Wilks ); parametric or nonparametric method Anti-log transformation to be applied to get the final cut point.
抗体的检测实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习抗体检测的基本原理和方法，掌握酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，并通过实验验证抗体在特定抗原存在下的反应情况。
二、实验原理抗体检测是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）技术进行定量或定性分析。
在实验中，将抗原固定在固相载体上，加入待测样本，若样本中含有特异性抗体，则与固相抗原结合形成抗原抗体复合物。
随后加入酶标记的抗体，该抗体与抗原抗体复合物中的抗体结合，形成酶标记抗体-抗原抗体复合物。
最后加入底物，在酶的催化下产生颜色变化，根据颜色深浅可判断待测样本中抗体的含量。
三、实验材料1. 试剂：抗原、酶标记抗体、底物、洗涤液、终止液、缓冲液等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、微量离心机、冰箱、培养箱等。
3. 样本：待测血清。
四、实验步骤1. 制备抗原包被板：将抗原稀释后，加入96孔板，每孔100μl，4℃过夜。
2. 洗板：用洗涤液清洗孔板，去除未结合的抗原。
3. 加待测血清：每孔加入100μl待测血清，37℃温育1小时。
4. 洗板：用洗涤液清洗孔板，去除未结合的血清。
5. 加酶标记抗体：每孔加入100μl酶标记抗体，37℃温育1小时。
6. 洗板：用洗涤液清洗孔板，去除未结合的酶标记抗体。
7. 加底物：每孔加入100μl底物，37℃温育15分钟。
8. 酶标仪检测：在酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。
9. 绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
10. 计算待测样本中抗体含量：根据待测样本的OD值，在标准曲线上查找对应的抗体浓度。
五、实验结果1. 标准曲线绘制：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测样本抗体含量计算：根据待测样本的OD值，在标准曲线上查找对应的抗体浓度。
六、实验讨论1. 实验过程中，洗板操作要轻柔，避免气泡产生，以免影响实验结果。
2. 在加待测血清和酶标记抗体时，应避免交叉污染。
抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)
抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则摘要:几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体(anti-drug antibody, ADA)反应,抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。
在人体内,抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。
但是对于某些治疗性蛋白质,抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应,包括温和事件及严重不良事件。
临床前研究表明,抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。
因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。
为了评估生物药物分子的免疫原性,以及将实验结果与临床事件联系起来,在临床前研究和临床研究中,很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。
这里方法学验证显得尤为重要,并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。
现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限,特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。
因此,本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。
在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。
笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。
这些建议被视为最佳的例子,旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。
1.简介:生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸,一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达,比常规的小分子药物更大(一般大于1~3KD)。
由于以上特性,生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。
生物制药的免疫原性与产品的内在因素(种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂)、外在因素(给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量)、患者因素(自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法)相关。
抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状,包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征(例如,药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使药物的的疗效发生改变)。
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Dynamic cut-point
Mean+1.645*SD or 95th percentile Robust alternative
Determine CP in each in-study run
Validation cut-point
NC.IS*(CP.V/NC.V), if log NC.IS+(CP.V – NC.V), if not
0.08
0.07
0.06 0.05 0.04
0.03
Not OK
1
2
3 Run
4
5
6Hale Waihona Puke 0.02 0.01 0.00 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 Mean Indiv idual Samples
• Check suitability of the negative control by plotting the mean response of the individual samples per run against the mean of the negative control of the same run
from Zhang et al, JIM, 389 (2013) 79–87
Steps for CP determination
Sample data normalization by dividing by the average NC response on the same plate S/N ratio is obtained for each sample in each run Logarithmic transformation applied to all SN values Detect and removal of analytical outliers (Grubbs’ test) Eliminate and delete biological outliers by Boxplot method with 3IQR Normality test (Shapiro-Wilks ); parametric or nonparametric method Anti-log transformation to be applied to get the final cut point.
Linear Fit
• Normalization is not beneficial if the relationship has zero or negative slope value
Acceptance Ranges for Assay Controls
Shankar et al: Acceptance ranges for the controls are defined based on the variability (SD) of the assay
Cut point determination (Outliers, Pre- versus in-study cut points) Assay controls (including NC, acceptance criteria) Pre-existing antibodies (anti-CCD, anti-PEG)
10
Pre-existing Antibodies
EMA (2016): „Some individual’s/patient’s samples may contain pre-existing (pre-treatment) antibodies or possibly other substances which produce significant positive responses in assays, and so screening patients for this is necessary to ensure that post-treatment data can be interpreted correctly in terms of treatment emergent antibodies.” FDA (2016): Pre-existing antibodies may have clinical effects and may affect the efficacy of the therapeutic protein product being tested. An alternative to the qualitative screening assay approach may be needed to assess the quantity and quality of ADA when pre-existing antibodies are present. For example, testing samples for an increase in ADA using a semi-quantitative assay type such as a titering assay can provide information on the impact of a therapeutic protein product on product immunogenicity that is not provided by a qualitative assay.
As the validation is performed in a limited timeframe the SD might not be representative for the variability throughout sample testing
• This might lead to a significantly higher failure rate than the anticipated 1%
Potential solutions.
• Use of ratios (e.g. to NC) as acceptance ranges • Re-determine acceptance ranges once significant assay failures are experienced
Effect of normalized signals
Suitability of the Negative Control
• Often a floating Cut-Point is used (e.g. log(S/N)) • However, normalization is not necessarily beneficial
1
Validation of ADA Assays –
Recent experiences and issues
2
Who is who?
3
Tiered Immunogenicity Approach
from EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 from 01 Dec 2017
Challenges in ADA analysis
Oneway Analysis of Result By Run
0.024 0.022 0.02 R e s u lt 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 1 2 3 Run 4 5 6
Mean NC
Mean NC
Bivariate Fit of Mean NC By Mean Individual Samples
Identify & exclude analytical outliers (AO) from each assay run/plate separately. Iterate until no more AO Then identify & exclude biological outliers (BO) by evaluating the distribution of subject averaged data. Iterate until no more BO. Then verify distribution of subject averaged data.
Sensitivity
Sensitivity per se is highly dependent on the positive control reagent(s) Assay sensitivity represents the lowest concentration at which the antibody preparation consistently produces a positive result. Shankar: Mean of the interpolated positive control at least 6 assay runs plus t0.05,df×SD FDA: Sensitivity should be at least 100 ng/ml as such antibody concentrations may be associated with clinical events
(CP.V)
NC.V = Neg. Control from Validation runs NC.IS = Neg. Control from In-Study run
Screening cut-point
from Shankar et al, 2008
Cut Point Determination (Zhang et al)
from Zhang et al, JIM, 389 (2013) 79–87
Analytical or Biological Outlier?