荧光定量PCR实验中的策略及注意事项
荧光定量pcr收集信号
荧光定量pcr收集信号荧光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，简称qPCR）是一种用于检测特定基因表达水平的技术。
它通过实时监测扩增过程中的荧光信号变化，实现对目标DNA分子数量的定量分析。
荧光定量PCR在生物学、医学等领域具有广泛的应用，为科研和临床诊断提供了有力的支持。
一、荧光定量PCR简介荧光定量PCR技术自1996年问世以来，得到了迅猛发展。
它的核心原理是利用特异性引物和荧光探针对目标DNA进行扩增，并通过检测扩增产物的荧光信号强度反映目标DNA的数量。
与传统PCR相比，荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。
二、荧光定量PCR实验步骤1.设计引物：根据目标基因序列，设计一对特异性引物，一端标记荧光探针。
2.模板准备：提取待检测样本的DNA，进行模板制备。
3.扩增：将模板DNA、引物、dNTPs等试剂加入PCR反应体系，进行循环扩增。
4.荧光检测：在扩增过程中，实时监测荧光信号变化，记录各周期扩增产物的荧光强度。
5.数据分析：根据荧光信号强度，计算目标DNA的数量。
三、荧光定量PCR数据处理与分析1.计算Ct值：Ct值（threshold cycle）是指目标DNA扩增至某一荧光强度时所需的循环数。
通过测量不同浓度模板DNA的Ct值，可以得到标准曲线。
2.计算相对表达量：根据标准曲线，计算各样本目标DNA的相对表达量。
3.数据分析：利用统计方法对实验结果进行差异分析，判断基因表达水平的变化。
四、荧光定量PCR应用领域1.基因表达研究：荧光定量PCR技术已成为研究基因表达调控的重要手段，广泛应用于基因功能研究、信号通路解析等领域。
2.疾病诊断：荧光定量PCR技术在病原体检测、遗传病诊断等方面具有重要应用价值。
3.药物研发：荧光定量PCR技术可用于药物靶点筛选、药物作用机制研究等。
五、注意事项1.实验操作过程中要严格防止污染，佩戴一次性手套、口罩等。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR注意事项
荧光定量PCR 注意事项一、基本步骤：1、目的基因的查找和比对；2、引物设计；3、引物合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1 目的基因（DNA 和mRNA）的查找和比对从/网点的genbank 中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar 软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar 软件中的Seqman 软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq” 的所有文件，点击“add” 或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble” 进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig) ，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project” 菜单下的“parameter” ，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
荧光定量pcr甲基化检测指导原则
荧光定量pcr甲基化检测指导原则1.引言荧光定量PCR甲基化检测是一种常用的分子生物学技术，用于研究DNA 甲基化的程度和模式。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，对基因表达和细胞分化起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测DNA甲基化状态对于研究生物学过程、疾病诊断和治疗具有重要意义。
本文旨在介绍荧光定量PCR甲基化检测的原则和方法，以帮助研究人员准确地进行该项实验。
2.实验准备2.1 样本采集与处理收集目标组织或细胞样本，并根据需要进行适当处理。
样本处理过程中应避免DNA污染或降解。
2.2 DNA提取选择适当的DNA提取方法，根据样本类型选择合适的提取试剂盒，并按照说明书进行操作。
确保提取到高质量、高纯度的DNA。
3.荧光定量PCR反应体系设计3.1 选择引物与探针根据目标位点设计合适的引物与探针。
引物应具有高特异性，避免引物间的相互作用。
探针应具有高亲和性和特异性，以确保准确的信号检测。
3.2 反应体系优化根据实验需要优化反应体系的浓度和组分。
反应体系包括模板DNA、引物、探针、酶和缓冲液等。
3.3 荧光信号检测选择适当的荧光信号检测方法，如荧光增长曲线分析或终点荧光分析。
根据实验需要选择合适的荧光通道。
4.标准曲线与定量分析4.1 构建标准曲线根据实验需要构建合适的标准曲线，以定量目标DNA甲基化程度。
标准曲线可以使用合成DNA片段或已知甲基化程度的DNA样本构建。
4.2 定量分析根据标准曲线对样本中目标位点甲基化程度进行定量分析。
计算每个样本中目标位点甲基化水平，并进行统计学分析。
5.质量控制与结果解读5.1 质量控制在每个实验中设置质量控制样本，用于检测实验的准确性和可重复性。
确保实验结果的可靠性。
5.2 结果解读根据定量分析结果，解读样本中目标位点的甲基化状态。
根据实验目的和研究问题进行结果分析和讨论。
6.实验注意事项6.1 防止DNA污染在实验过程中，应注意避免DNA污染。
使用无菌、无DNA污染的试剂和器具，并在操作过程中避免接触裸露的DNA。
荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量PCR技术的使用教程
荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。
荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。
第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。
2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。
应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。
3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。
4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。
6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。
7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。
8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。
第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。
2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。
第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。
2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。
- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。
荧光定量pcr实验小结
荧光定量pcr实验小结荧光定量 PCR 实验小结荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于定量检测特定核酸序列的含量。
在经历了多次荧光定量 PCR 实验后，我积累了不少经验，也遇到了一些问题，在此进行一个小结。
一、实验原理荧光定量 PCR 的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
在 PCR 反应过程中，随着产物的增加，荧光信号也会相应增强。
通过检测荧光信号的变化，可以确定 PCR 反应的起始拷贝数。
二、实验准备1、试剂和耗材选择高质量的 PCR 引物和探针，确保其特异性和有效性。
准备合适的 PCR 反应缓冲液、dNTPs、Taq 酶等试剂。
使用无菌、无核酸酶污染的离心管、移液器吸头和 PCR 板。
2、样本制备提取高质量的核酸样本，如 DNA 或 RNA，并确保其纯度和完整性。
对 RNA 样本进行反转录，得到 cDNA 用于后续的 PCR 反应。
3、仪器设备荧光定量 PCR 仪，需要提前进行校准和维护，确保其性能稳定。
三、实验步骤1、反应体系配制根据实验要求，计算并配制合适体积的 PCR 反应体系。
将各组分依次加入离心管中，充分混匀，避免产生气泡。
2、加样使用移液器将反应体系准确地加入到 PCR 板的各个孔中。
加入待测样本和标准品，注意更换移液器吸头，防止交叉污染。
3、上机运行将 PCR 板放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序和参数。
启动仪器，开始进行 PCR 反应，并实时监测荧光信号。
四、实验中的关键环节1、引物和探针设计引物和探针的设计直接影响实验的特异性和灵敏度。
要选择合适的序列，避免引物二聚体和非特异性扩增。
可以使用在线设计工具，并结合相关文献进行优化。
2、反应条件优化退火温度是影响 PCR 反应特异性的重要因素，需要通过梯度 PCR进行优化。
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荧光定量PCR实验中的策略及注意事项前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。
考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。
如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。
近两年没有人再讲这类的话了。
Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。
对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。
因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。
其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。
并且要进行较多的实验条件的优化。
这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。
另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman 和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法选择单通道实验还是多通道实验？这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。
多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。
但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。
还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。
因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。
可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。
三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。
因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。
双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。
对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。
至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。
这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
引物设计中的几个注意事项1、引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。
2、引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。
3、在进行mRNA表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增4、由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly（T）作引物，则设计的片段尽量靠近poly（A），以免逆转录的效率影响到实验结果。
如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题5、产物片段的大小：定量PCR一般产生片段都不大，不会超过600bp。
Sybr Green法一般选择250-600bp，过大会影响到PCR扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。
Taqman法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。
Molecular beacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。
Sybr Green法的实验策略：实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。
一、实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，1、要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR 产物等。
有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR的实验条件，也可以此为基础进行实验。
2、扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。
当然，能测个序什么的最好。
并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。
3、有了基本的PCR条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。
将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。
选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。
4、如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。
其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。
二、预实验阶段按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。
另一个目的看样本中是否有PCR抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR抑制物浓度较高。
可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。
因为样本RNA 的提取试剂中经常有抑制PCR反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR反应。
三、正式实验阶段然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。
有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。
最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。
Sybr Green法的注意事项1、最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本2、Sybr Green I一般是先将母液用DMSO进行稀释100倍，最终的使用浓度为4000-10000分之一。
可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR反应。
另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短，一般1周后就不能用了。
DMSO似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。
3、在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。
4、当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。
但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR反应，消除引物二聚体的影响也没有用。
5、大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC（t）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。
但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC（t）来计算了。
这是错误的，会得到错误结论。
6、无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。
7、不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。
8、最好使用高质量的PCR管，低质量管的管间差可能会很大。
9、每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。
10、在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。
只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。
其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。