E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
E2F-1真核表达载体的构建和Genectin抗性细胞的筛选
E2F-1真核表达载体的构建和Genectin抗性细胞的筛选王长青;尹永硕;李雷;谢玉波;肖强【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2010(050)048【摘要】目的通过构建含E2F-1基因的真核表达载体,转染胃癌细胞MGC-803,获得Genectin抗性的稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株.方法 PCR扩增E2F-1基因片段,经限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选.用脂质体Lipofectamine 2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株.RT-PCR和Western blot技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况.结果重组载体pCMV-E2F-1-HA2经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得到预期片段,测序结果与报道的E2F-1基因完全一致.获取具Genectin抗性的细胞克隆,并进行了扩增.RT-PCR和Western blot证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1.结论成功获取具Genectin抗性的稳定过表达E2F-1的胃癌细胞株,为下一步的功能实验奠定了基础.【总页数】3页(P19-21)【作者】王长青;尹永硕;李雷;谢玉波;肖强【作者单位】深圳市宝安人民医院,广东深圳518101;东莞市人民医院;广西医科大学附属第一医院;广西医科大学附属第一医院;广西医科大学附属第一医院【正文语种】中文【中图分类】R735.2;R73-35【相关文献】1.重组HBsAg真核表达载体的构建及其稳定转染H22细胞的筛选 [J], 周晓晶;万敏;卫红飞;王丽颖;吴秀丽2.人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定 [J], 毛成毅;杜娟;马瑜;李向云;敖罗权;徐祥;肖华亮3.PRKACB基因真核表达载体的构建及稳转细胞株的筛选 [J], 郭剑波;陈拥;田大力;高英4.E2F-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株MKN-45增殖的影响 [J], 王长青;肖强;李雷;谢玉波;谭宁;宫志伟5.以新霉素抗性基因突变体为筛选标志的真核表达载体的构建 [J], 高川;朱旭东;周晓巍;于芳;卢柏松;黄培堂因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CRBP1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟【摘要】目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ，CRBP-1)基因RNAi（RNA interference，RNAi）慢病毒载体。
方法：针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1 基因RNAi 有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Hpa I 和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。
结果：PCR 鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。
结论：成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi 慢病毒载体。
【关键词】 RNA干扰；视黄醇结合蛋白-1；慢病毒[Abstract] Objective：To construct a lentiviral vector of RNA interference（RNAi） of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods：The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed，synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector，to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA)， and it was identified by PCR and DNA sequencing. Results：PCR identification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right.Conclusion：The lentivirus RNAi vector of rat CRBP-I was constructed successfully.[Key words] RNA interference；Cellular retinol-binding protein I；Lentivirus肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节[1]，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002年Uchio K[2]在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。
APE1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
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８ ６
福 建 医科 大 学学 报
２１ ０ ０年 ４月 第 ４ ４卷第 ２ 期
Ａ Ｅ 基 因 Ｒ Ａ 慢 病 毒 载体 的构 建 与 鉴定 Ｐ１ Ｎ ｉ
李艳 菊 ，郑智 华 ，刘景 丰。 ，高 美钦 ，黄 爱 民
摘要 ： 目的 构 建 ＡＰ １基 因 慢 病 毒 载 体 ， Ｅ 为其 后 续 的 体 内 外 实 验 研 究 提 供 基 础 。 方 法 应 用 基 因 工 程
与细胞 的增 殖 、 亡 和 分 化 等 多 种 关 键 的 细 胞 反 凋
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rnai载体构建流程
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1. 选择RNAi靶序列。
根据基因靶向位点选择19-25nt的特定序列。
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。
方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。
结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。
结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。
【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。
慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展
慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【摘要】为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础.慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)008【总页数】5页(P116-120)【关键词】转基因;慢病毒载体;载体构建策略【作者】孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S813.3转基因技术使人类根据主观意愿定向改变生物体的性状表型成为可能,而载体种类和质量直接关系到后续转基因的效率,所以表达载体构建成为转基因研究的关键环节之一。
相比较而言,质粒载体、噬菌体DNA载体和人工染色体载体需要借助于昂贵的显微操作仪,并因极低的整合率影响了转基因的效率。
转座子载体虽有较好的应用前景并大量应用于低等动物转基因,但由于受构建哺乳动物高效转座子技术瓶颈的限制,近期内很难在高等动物中取得进展。
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
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王 翔， 胡治平 ， 伟 ， 湘祁， 卢 唐 张 洁， 婷 ， 李 曾六旺
４ Ｄ１） １０ １ （ 湖南省长沙市 中南大学湘雅二 医院神经 内科 ， 长沙
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颗粒。各组病毒载体转染 Ｔ ａｌ３细胞后 ， ｃａ １ 运用 Ｒ ａ ＴｍｅＰ Ｒ和 Ｗｅｔ ｎ检测三组 Ｅ Ｆ １ Ｎ ｅｌ ｉ Ｃ — ｓｒ ｅ ２ 一 ｍＲ Ａ和蛋 白的表达 水平 。结果 ： 经酶切 和测序证 明，Ｌ Ｏ．一Ｕ Ｏ Ｕ 一２ 一ｓＲ Ａ序 列正确 ； ｐ Ｋ １Ｐ Ｒ — ６Ｅ Ｆ１ｈ Ｎ 转染后 ， 各组慢病毒 载体 中 ， 第一组质粒感染后 的 Ｔ ａ １３细胞 ｃ８ １
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江 飞 ， 袁 华 ， 思 阳， 丁 牛玉 明 ， 杜一 飞 ， 陈 宁
（ 南京 医科 大 学 口腔 医学研 究所 ・附属 口腔 医院 口腔颌 面 外科 ，江 苏 南京 ２ ０ ２ ） １０ ９
［ 要 ］ 目的 ： 建和 鉴 定 靶 向 Ｅ Ｆ１ 因 的 Ｒ Ａ 干扰 慢 病 毒 载 体 。方 法 ： 外 合 成 两 对 互 补 并 编 码 靶 向 Ｅ Ｆ１ 因 的特 异 摘 构 ２ 一基 Ｎ 体 ２ 一基 性 短发 夹 Ｒ Ａ（ｈ ｒｈｉ ｉ Ｒ Ａ， Ｒ Ａ） 列 和 一 个 阴性 对 照 组 的 寡 核 苷 酸 ， 隆 到 ｐ Ｋ ． 一Ｕ Ｏ Ｕ （ ｇ ／ ｃＲ Ｉ 质 粒 Ｎ ｓｏ ａ ｐ Ｎ ｓ Ｎ 序 ｔ ｒｎ ｈ 克 Ｌ Ｏ １Ｐ Ｒ — ６ Ａ ｅＩＥ ｏ ） 载 体 中 ． 酶 切 和 测序 鉴 定所 构 建 的重 组 载 体 是 否 正 确 ， 以 上 质 粒 分 别 和 包 装 质 粒 混 合 物 共 转 染 ２３ 经 将 ９ Ｔ细 胞 ． 装 产 生 病 毒 包
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