液相色谱_串联质谱法测定牛奶中5种多肽类抗生素_刘佳佳

关键词 液相色谱-串联质谱； 牛奶； 多肽； 残留
1引言
多肽类抗生素是由不同类型的氨基酸缩合而成的小分子肽类，主要用于促进动物生长及治疗畜禽 疾病。目前，多肽类抗生素被广泛用于家禽、猪、牛等饲料添加剂和兽药［1 ～ 3］。常用的多肽类抗生素包 括粘杆菌素、杆菌肽、维吉尼霉素及万古霉素等［4，5］。然而，随着多肽类抗生素的广泛使用，滥用及不遵 守休药期等现象时有发生。药物将可能通过食物链的传递进入人体，危害人体健康。如果长期暴露，还 会增加细菌的抗药性［6］，具有潜在的健康风险和生态风险。
第 39 卷 2011 年 5 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE） 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry
第5 期 652 ～ 657
DOI： 10． 3724 / SP． J． 1096． 2011． 00652
液相色谱-串联质谱法测定牛奶中 5 种多肽类抗生素
图 1 5 种多肽类抗生素的二级质谱图 Fig． 1 Product ion spectra of five peptides antibiotics
a． 维吉尼霉素（ Virginiamycin） ； b． 杆菌肽 A（ Bacitracin A） ； c． 万古霉素（ Vancomycin） ； d． 粘菌素 A（ Colistin A） ； e． 粘菌素 B （ Colistin B） 。
2010-07-28 收稿； 2010-11-10 接受 本文系“十一五”国家科技支撑计划项目（ No． 2006BAD12B03 -06） 资助 * E-mail： w_jing2001@ 126． com
第5 期
刘佳佳等： 液相色谱-串联质谱法测定牛奶中 5 种多肽类抗生素
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杆菌肽纯度 92% 、粘杆菌素纯度 99% 、万古霉素纯度 95% （ Sigma 公司） 。 2． 2 实验方法 2． 2． 1 标准溶液的配制 分别称取杆菌肽、粘杆菌素、万古霉素的标准品各 0． 01 g （ 精确至 0． 000001 g） ，用 0． 1% 甲酸溶解并定容至 100 mL； 称取维吉尼霉素标准品 0． 01 g （ 精确至 0． 000001 g） ，用甲醇溶 解并定容至 100 mL，制得 100 mg / L 的标准储备液，在 4 ℃ 下背光储存。根据需要，用乙腈-0． 2% 甲酸（ 1 ∶ 9，V / V） 溶液稀释成不同浓度的标准工作液，即用即配。 2． 2． 2 样品前处理 取 2 mL 牛奶，加入 10 mL 甲醇-水-甲酸（ 28∶ 72∶ 0． 1，V / V） 提取液，1 mL 4% 三氯 乙酸乙腈溶液，涡旋 3 min，超声 5 min，4 ℃ 下以 10000 r / min 离心，取上清液，氮气吹干，用 2 mL 乙腈0． 2% 甲酸溶液（ 1∶ 9，V / V） 溶解。加入 5 mL 正己烷，涡旋混匀，以 10000 r / min 离心 5 min，弃去正己烷 层，重复1 次，将下层溶液过 0． 22 μm 滤膜后移入进样瓶中，供 HPLC-MS / MS 分析。 2． 2． 3 色谱-质谱条件 采用 Waters Sunfine C18 色谱柱（ 50 mm × 2． 11 mm，5 μm） ； 柱温 30 ℃ ； 进样体 积 5 μL。流动相为含 0． 1% （ V / V） 甲酸的乙腈溶液（ A） 和含 0． 1% （ V / V） 甲酸-水溶液（ B） ，流速为 0． 20 mL / min，梯度洗脱： 0 ～ 3 min，85% ～ 60% A； 3 ～ 5 min，60% ～ 50% A； 5 ～ 14 min，50% ～ 10% A； 14 ～ 18 min，10% ～ 85% A； 18 ～ 25 min，85% A。
母离子 Parent ion
（ m /z） 725． 0
386． 0
391． 0
712． 2
526． 2
子离子 Daughter ion
（ m /z）
144． 2 * 130704．． 35 380． 4 3*79． 4 385． 019*9． 2 356． 325*5． 0 337． 2*
保留时间 Retention time
3． 2 色谱条件的选择 由于多肽类抗生素本身带有较多的氨基和羧基，对 pH 值有严格的要求。实验比较了 0． 1% 甲酸溶
液-乙腈、0． 1% 乙酸溶液-乙腈、5 mmol / L 甲酸铵-0． 1% 甲酸溶液-乙腈对离子化的影响。结果表明，0． 1% 甲酸-乙腈体系能使多肽类在质谱中有最好的响应值，这是由于甲酸可以为阳离子的形成提供必需 的质子来源，从而提高其离子化效率，因此选用甲酸作为酸度调节剂。但是 0． 1% 甲酸溶液-乙腈作为 流动相时，粘杆菌素 A 色谱峰拖尾严重，如图 2a 所示。由图 2b 可见，在 0． 1% 甲酸-0． 1% 甲酸乙腈体系 下，甲酸可以使色谱柱内硅胶硅醇基质子化，从而减弱硅醇基与多肽药物之间的相互作用，使得色谱峰 型尖锐，且拖尾现象减少。此外，由于多肽本身不稳定，在 40 ℃ 以上很可能会部分分解，而当柱温低时
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分析化学
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类似，万古霉素的双电荷离子作为母离子产生碎片离子 m / z 100． 3，144． 2 等子离子，质谱图和断裂方式 如图 1c 所示，选择丰度最大的 m / z 144． 2 作为定量离子。粘杆菌素 A 和粘杆菌素 B 分子量以三电荷离 子 m / z 391． 0 和 386． 0 为母离子。但是由于加上 3 个质子后，化合物裂解产生改变，粘杆菌素 A 和粘杆 菌素 B 的二级离子质谱图见图 1d 和 1e。
分析物 Analyte
分子量 Molecular
weight
万古霉素 Vancomycin
1448
粘杆菌素 B Colistin B
1155
粘杆菌素 A Colistin A
1169
杆菌肽 A Bacitracin A
1422
维吉尼霉素 M1 Virginiamycin M1
525Biblioteka * 定量离子 （ Quantification ion） 。
目前，多肽类抗生素检测方法包括微生物法、免疫分析法［7］、高效液相色谱法（ HPLC） ［8，9］、毛细管 电泳法［10］等，但这些方法均存在灵敏度低等问题，无法满足粘杆菌素的 50 μg / kg 的检出限要求。有关 同时检测这 5 种多肽的研究尚未见报道。近年来，HPLC-MS / MS 检测方法在痕量分析中的应用广泛，已 有用 HPLC-MS / MS［3，6，11］检测多肽的报道。但该方法前处理方法复杂，检出限仍无法满足现有国际限量 的要求。本实验采用快速前处理步骤，同时检测牛奶中 5 种多肽类抗生素，方法简单、实用。
刘佳佳 金 芬 佘永新 刘洪斌 史晓梅 王 淼 王 静* 徐思远
（ 中国农业科学院农产品质量与食物安全重点实验室，中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）
摘 要 建立了牛奶中杆菌肽、粘杆菌素 A、粘杆菌素 B、维吉尼霉素和万古霉素 5 种多肽类抗生素的反相液 相色谱-串联质谱（ HPLC-MS / MS） 检测方法。牛奶样品经甲醇-0． 1% 甲酸水提取后，用 4% 三氯乙酸乙腈除蛋 白，液-液萃取后，采用 0． 1% 甲酸 （ A） 和 0． 1% 甲酸乙腈（ B） 作为流动相进行梯度洗脱，质谱（ ESI + ） 采用多 离子检测模式（ MRM） 对两价态或三价态的定性和定量离子进行监测。结果表明，5 种多肽类抗生素在 25， 50 和100 μg / kg 的添加水平的回收率为 75． 1% ～ 120． 1% ； 相对标准偏差小于 15． 7% ； 方法检出限为 0． 2 ～ 5． 6 μg / kg。本方法前处理操作快速简单，重复性好，满足对牛奶中多肽类抗生素的快速、准确的检测要求，适合 大量样品的准确定性和定量分析。
［M + nH］n + 离子作为母离子进入二级质谱后发生断裂或重排等反应产生不同碎片离子。如图 1a 所示，［M + H］+ 作为维吉尼霉素的母离子产生有显著丰度的 m / z 337． 2 及 355． 0 离子碎片，其中 m / z 337． 2 丰度最高，作为定量离子。［M + 2H］2 + 作为杆菌肽 A 的母离子产生有显著丰度的 m / z 199． 2， 253． 4，356． 2 等子离子，选择丰度最大的 m / z 356． 2 作为定量离子。其断裂的机理如图 1b 所示。与之
3 结果和讨论
3． 1 质谱条件的优化 5 种多肽类抗生素（ 万古霉素、粘杆菌素 B、粘杆菌素 A、杆菌肽 A 和维吉尼霉素 M1 ） 是由氨基酸缩
合而成的肽类物质，分子量从 525 到 1448。在进入一级质谱后，容易与一个或多个 H + 结合，产生带正 电的单电荷或多电荷离子。维吉尼霉素是分子量最小的多肽类抗生素，分子量 525，与 H + 结合，产生稳 定的准分子离子峰 m / z 526。而万古霉素、粘杆菌素 B、粘杆菌素 A 和杆菌肽 A 的分子量均超过 1000， 在进入一级质谱后，能产生不同丰度的双电荷离子和三电荷离子。选择丰度最大的双电荷离子（ ［M + 2H］2 + ） m / z 712． 2 和 725． 0 分别作为杆菌肽 A 和万古霉素的母离子。而对于粘杆菌素 B 和粘杆菌素 A，本研究分别比较了在 0． 1% 甲酸水溶液中双电荷离子 m / z 586、578 和三电荷离子 m / z 391． 0、386． 0 的响应值。三电荷离子（ ［M + 3H］3 + ） 的丰度大于双电荷离子（ ［M + 2H］2 + ） ，所以本研究选择丰度最 大的三电荷离子 m / z 386． 0 和391． 0 分别作为粘杆菌素 B 素和粘杆菌素 A 的母离子。
多肽类抗生素可分别抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染， 特别是对牛乳腺炎等疾病有较好的疗效。目前，欧盟、日本、美国、澳大利亚等均已制定牛奶中多种多肽 类抗生素的限量。其中，欧盟对杆菌肽 A 及粘杆菌素的限量分别为 100 和 50 μg / kg； 日本对杆菌肽 A、 维吉尼霉素、万古霉素、粘杆菌素的限量分别为 400，100，10 和 10 μg / kg。而我国也于近年制定了牛奶 中杆菌肽 A 及粘杆菌素的限量，分别为 500 和 50 μg / kg。关于多肽类抗生素的检测方法逐渐引起了关 注。