三悬浮细胞与贴壁细胞的培养与观察.ppt

天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和 牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验
结果的分析。
易发生支原体污染
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数
量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培
养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
6、加入适量无钙镁PBS或培养基清洗一遍，立即倒掉。
7、加入含有10%血清的培养基，用吸管吹打细胞，
一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中， 再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养 瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，在瓶外注明细胞 名称、日期、实验人员姓名等，放入CO2培养箱中进 行培养。 对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离 心，1000 rpm / 5 min，然后，换入新的培养基即可， 再分装到不同的培养瓶中进行培养。 不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细 胞间空隙增大、变形、不规则，失去原有的特点。
通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉
素、链霉素最终使用浓度为每毫升100u。
完全培养基的组成
基础培养基 血清 碳酸氢钠 青、链霉素
80％一95％ 5％一20％
2.0 g/L 各100卑位／毫升
完全培养基的配制
RPMI-1640培养粉 碳酸氢钠 青、链霉素
1袋
2.0 g 各100单位／毫升
正常细胞生长曲线图
复习思考题：
细胞培养的过程中应注意哪些事项？
2. 根据计数结果，每个方瓶中接种细胞3×105个，加 3ml培养基，共接种7瓶（由于是学生实验，细胞用量 较大，故每实验组不做重复计数，最后可用每班所计 数的值求均数。也可接种9瓶细胞，计数9天）。
3. 每间隔24h，共7天，分别计数每瓶细胞数。 4. 计数时，用胰酶消化至镜下见细胞缩成圆形，用一
③激素 ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可 以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血 清．
血清中不仅存在促细胞生长因子，提供细胞体外适于 生存的微环境．
血清质量好坏是实验成败的关键。
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染 4 无毒
实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌
抗菌素的使用：
在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以
抑制可能存在的细菌的生长。
悬液再传代。
2 半悬浮生长细胞传代
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁
不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来， 进行传代。
3 贴壁生长细胞传代
采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25
％的胰蛋白酶液。
一、实验目的
1. 掌握观察体外培养细胞的形态及生长状况的方法。 2. 掌握细胞传代的方法。
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表
面。见于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮
期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化
合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生
长需要。
人工合成培养基只能维持细胞生存，
要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量
的天然培养基（如血清）。
血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子
般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研
究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
实验器材与试剂：
1、器材：细胞培养所需器材（同前）、细胞计数器、 倒置显微镜、细胞计数板、微量加样器、塑料枪头等
2、试剂：完全培养基、无钙镁PBS、0.25%胰酶溶液、 0.5%台盼蓝染液、药物
正常细胞生长曲线的测定：
1. 胰酶消化细胞，用新鲜培养基中止，轻轻吹打，制 成细胞悬液，计数。
培养瓶（小方瓶或中方瓶）、华氏管等。（上 述器材需彻底清洗，玻璃器材160˚C烤干或塑 料器材烘干，包装后高压蒸汽灭菌30min或辐 照灭菌，备用。）超净工作台、倒置显微镜、 酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、废液缸 等。
3. 试剂：无钙镁PBS溶液、0.25%胰蛋白酶等。
四、实验内容
1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作 前，用75% 的酒精擦拭双手，注意指间，和 指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。2） 将培养液放置室温，备用。3）打开超净台内 的紫外灯，照射20 min。同时，将实验所需材 料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外） 4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已 经长满培养瓶，需要进行分瓶。
实验三 悬浮细胞与贴壁细胞 的培养与观察
细胞培养的基本概念
细胞传代：
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种 到新的培养器皿中。
细胞系 cell line 细胞株 cell strain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长：
必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体
瘤细胞
悬浮生长：
②保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升， 以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养板
培养瓶
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
8、结果观察 一般情况下，传代后的贴壁细胞在2h后贴壁，2~4d可
在瓶底形成单层，需要再次进行传代。
细胞培养过程中，需要每天在倒置显微镜下进行观察， 重点注意以下几点：
1） 观察细胞是否污染。注意培养液的颜色变化与澄 清与否。
2） 观察细胞是否增殖，细胞密度是否发生变化。 3） 观察细胞形态特征。 4） 对活细胞占细胞总数的比例，可用0.5%台盼蓝染
液进行染色。
五、注意事项
注意每个操作环节，严格防止细胞污染。传代或换液 24~ 48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养 液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢， 生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液 不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即 从培养箱中取走，以免污染其它细胞。
细胞生长曲线的测定 （示教）
原理：
生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的 常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细 胞生物学特性的基本参数之一。生长曲线常用于测定 细胞体外生长的趋势或药物等外来因素对细胞生长的 影响。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮到贴壁，随后经 历潜伏期，再进入大量分裂的指数生长期。在细胞达 到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰 亡。
超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机驱 动空气遁过高效滤器 除去空气中的尘埃颗 粒，使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
滤器
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ， 5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注 意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需 将瓶盖微松，以保证通气。
细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限
度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的
PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用
滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液， 分天然培养基和合细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋
白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于
底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
调节pH值至7.2
加血清（终浓度 10％）
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：
1 悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物
加新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培
养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞