黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化_抑菌作用研究

黄鲫胃蛋白酶酶解液体外抗氧化、抑菌作用研究宋 茹1,2，汪东风2，谢 超1，王 铣1(1. 浙江海洋学院食品与药学学院，浙江 舟山 316004；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)摘 要：采用胃蛋白酶水解黄鲫，测定酶解液的蛋白提取率、可溶性肽含量、水解度及氨基酸组成，并对酶解液体外抗氧化和抑菌作用进行研究。

结果表明：黄鲫胃蛋白酶酶解液的蛋白提取率、可溶性肽提取率、水解度分别为 (110.28±4.81)%、(81.78±0.04)%和 (18.12±0.39)%，黄鲫胃蛋白酶酶解液的人体必需氨基酸相对含量可达37.91%。

黄鲫胃蛋白酶酶解液具有很强的抗氧化能力，清除羟自由基和DPPH 自由基的ED 50分别为4.55μg/mL 和4.46μg/mL ，还原力随着黄鲫胃蛋白酶酶解液质量浓度的增加而增大，在3.4μg/mL 和13.6μg/mL 低、中质量浓度时螯合金属离子能力与EDTA 接近。

体外抑菌实验显示：黄鲫胃蛋白酶酶解液具有广谱抑菌性，对大肠杆菌的抑菌效力分别与 13.21～15.44mcg/mL 的氨苄青霉素和 325.00～340.00U/mL 的硫酸链霉素相当 (P ＞0.05)。

关键词：黄鲫；胃蛋白酶；酶解液；抗氧化作用；抑菌作用in vitro Antioxidant and Antibacterial Activities of Pepsin Hydrolysate of Half-fin Anchovy (Setipinna taty )SONG Ru 1,2，WANG Dong-feng 2，XIE Chao 1，WANG Xian 1(1. College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China ；2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)Abstract ：Half-fin anchovy (Setipinna taty ) homogenate was hydrolysated by pepsin. Protein yield, contents of soluble peptides and degree of hydrolysis were analyzed and in vitro antioxidant and antibacterial activities of the hydrolysates were also evaluated.Results showed protein extract rate, soluble peptides contents, degree of hydrolysis of half-fin anchovy pepsin hydrolysate were (110±4.81)%, (81.78±0.04)% and (18.12±0.39)%, respectively. The relative contents of essential amino acids in half-fin anchovy hydrolysate (HAH) reached 37.91%. HAH showed strong radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH radicals with the ED 50 values of 4.55μg/mL and 4.46 μg/mL, respectively. The reducing power increased with rising concentration and the metal chelating ability was equivalent to that of EDTA at the 3.4μg/mL or 13.6　μg/mL. HAH displayed broad antibacterial spectra in vitro and the antibacterial effecacy against Escherichia coli was equal to 13.21－15.44 mcg/mL of ampicillin of and 325.00－340.00 U/mL of streptomycin sulfate (P ＞0.05).Key words ：half-fin anchovy (Setipinna taty )；pepsin ；hydrolysates ；antioxidant activity ；antibacterial activity 中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)03-0127-05收稿日期：2009-07-31基金项目：舟山市科技计划项目(Y20082086)作者简介：宋茹(1976—)，女，讲师，博士研究生，研究方向为食品加工与检验。

E-mail ：happysong545@黄鲫(Setipinna taty )属鳀科，黄鲫属，在我国南海、东海、黄海、渤海海域可常年捕获，且产量较大[1]。

但其个体小且肉薄、刺多，目前主要是加工成干制品。

国内外学者通过酶解方式从加工利用率低的海水鱼及废弃物中获得大量的生物活性物质，如：具有抗氧化作用的太平洋鳕鱼蛋白酶解液、金枪鱼骨蛋白肽[2-3]，牡蛎蛋白抗菌肽[4]，海鲷鳞血管紧张素抑制肽[5]等。

有关黄鲫蛋白酶酶解液生物活性的研究还未见报道，本研究在前期实验基础上对黄鲫胃蛋白酶酶解液的体外抗氧化作用和抑菌作用进行研究，旨在为黄鲫蛋白酶酶解液中活性物质的进一步分离纯化和鉴定提供参考。

１材料与方法1.1材料与试剂黄鲫购于舟山南珍水产市场。

大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i )、荧光假单孢菌(Ps eud omo nas f luo res cen s )、普通变形菌(Pr ot eu s vulgaris )、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa )、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium )、八叠球菌(Sarcina)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)为浙江海洋学院食品与药学学院、医学院食品实验室保存菌种。

胃蛋白酶、牛血清白蛋白、氨苄青霉素、硫酸链霉素、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)为生化试剂；二丁基羟基甲苯(BHT)食品级；其余试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备BS110S 型电子分析天平北京赛多利斯分析天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机上海标本模型厂；PP-20型pH计德国赛多利斯公司；HHS型电热恒温水浴锅海博迅实业有限公司医疗设备厂；EYELA N-10001旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司；LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；KDN-04C型数控消化炉上海新嘉电子有限公司；HWS型智能生化培养箱宁波江南仪器厂；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；Himae CF 16 RX型多功能离心机；UV-1200UV型紫外-可见分光光度计；PICO TAG氨基酸分析仪美国Waters公司。

1.3方法1.3.1黄鲫胃蛋白酶酶解液(HAH)制备黄鲫去内脏后洗净，组织捣碎机捣碎，按照一定比例加入去离子水混合，混合浆液用酸调节p H值到2.0，37℃保温10min，加入适量胃蛋白酶并搅拌均匀。

酶解过程中的前30min每隔15min加入少量盐酸或碱保持pH值在2.0。

反应结束后，95～100℃加热10min钝化灭酶。

混合液经低温(4℃)7000r/min离心10min，弃去上层油膜和底部残渣，留中间酶解液再经过滤可得澄清液体，－20℃保藏备用。

1.3.2蛋白提取率(NR)测定黄鲫经胃蛋白酶水解后，记录水解离心后上清液的总体积，然后取5mL水解液，用凯氏定氮法[6]分别测定上清液中蛋白含量及原料中总蛋白含量。

上清液中总蛋白质含量蛋白提取率/%=———————————×100原料中总蛋白质含量1.3.3可溶性肽含量测定采用三氯乙酸(TCA)沉淀法。

取水解后上清液5mL 于离心管中，加入5mL浓度为15%TCA液，摇匀并静置30min后，8000r/min 离心15min，凯氏定氮法测定5mL 酶解液总蛋白质及离心后上清液蛋白质含量。

TCA沉淀后上清液中总蛋白质含量可溶性肽含量/%=——————————————×100酶解液总蛋白质含量1.3.4水解度(DH)测定采用茚三酮比色法[6]测定上清液中游离氨基态氮量，凯氏定氮法测定原料总氮量。

上清液中游离氨基态氮总量水解液/%=——————————————×100原料总氮量1.3.5氨基酸组成分析取一定量黄鲫胃蛋白酶酶解液，加入6mol/L HCl 充氮气后，热融密封，110℃烘箱中水解24h，脱酸后，用水定容至适量浓度，用氨基酸分析仪测定。

1.3.6体外抗氧化能力测定1.3.6.1体外清除羟自由基和DPPH自由基体外清除羟自由基方法参照文献[7]略加修改。

取0.75mmol/L 邻二氮菲1mL于试管中，依次加入pH7.40的PBS缓冲液2mL，样品1mL，充分混匀后，加入0.75mmol/L 的硫酸亚铁1mL，混匀，加0.12%的H2O21mL，37℃保温90min，蒸馏水调零，536nm波长处测其吸光度，计作A s；用1mL蒸馏水代替1mL H2O2测其吸光度，记为A b；用1mL的蒸馏水代替1mL样品测其吸光度，记为A p。

A s－A p羟自由基清除率/%=—————×100A b－A p体外清除DPPH自由基测定方法参照文献[8]略加修改。

1.5mL样品同1.5mL 99.5% 乙醇混合，加上375μL 0.02% DPPH自由基的99.5%乙醇液，剧烈混合，室温暗室下放置60min，99.5%乙醇调零，测定517nm波长处吸光度，记作A样品；用1.5mL 蒸馏水代替1.5mL样品，其余条件同样品测定，记作A对照；用375μL乙醇代替375μL 的0.02% DPPH乙醇液，其余条件同样品测定吸光度，记作A空白。