平末端DNA随机连接构建重组质粒
ligation independent cloning-分子克隆技术
TEV酶切位点：ENLYFQ^S
TGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT CTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCG
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Ligation-independent cloning
1
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经典的克隆方法
经典的克隆方法，主要分为以下两 种：(1)粘性末端连接，即载体质粒 和待插入的外源片段都通过合适的 限制性内切酶切割，产生相互匹配 的粘性末端，然后在连接酶作用下 重新形成磷酸二酯键而得到环化的 重组质粒；(2)平末端连接，平末端 连接中，载体和片段均为平端，都 没有粘性末端突出。
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LIC方法的特点
➢ LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线性 载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的粘 性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要求。
➢ LIC方法的优势在于： (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
特定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片
段能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性末
端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法不
需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆
到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任何
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
DNA重组质粒的构建概述
DNA重组质粒的构建概述引言DNA重组质粒是现代生物学研究中常用的工具，它可以用来携带外源基因并在目标生物体中表达，从而实现对基因功能的研究和利用。
本文将概述DNA重组质粒的构建过程，包括选择质粒载体、外源基因的克隆插入以及构建质粒的鉴定等内容。
选择质粒载体质粒是细胞内独立存在的环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等单细胞生物中。
在构建DNA重组质粒时，选择一个适合的质粒载体非常关键。
常用的质粒载体有pUC19、pET28a、pET-DEST42等，在选择时可以根据实验需求考虑载体大小、选择标记物和基因表达系统等因素。
外源基因的克隆插入1. DNA片段的获取首先，需要获取外源基因的DNA片段。
这可以通过PCR扩增、基因合成或其他方法来获得。
在PCR扩增时，需要设计一对引物，使其能够特异性地扩增目标基因。
合成基因片段时，可以利用现代合成生物学的技术，将目标基因序列按照设计的引物进行人工合成。
2. 酶切和连接接下来，使用限制酶将质粒载体和外源基因片段酶切开。
酶切的目的是产生互补的黏性末端，使得质粒载体和外源基因片段可以互相连接。
选择适当的限制酶在切割时产生互补的黏性末端，使得连接更加有效。
然后，将质粒载体和外源基因片段连接在一起。
这可以使用DNA连接酶和连接试剂，在适当的条件下进行连接。
连接后的质粒称为重组质粒。
3. 转化宿主细胞将构建好的重组质粒转化到适当的宿主细胞中，使其能够在细胞内进行复制和表达。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
构建质粒的鉴定通过一系列实验，对构建好的质粒进行鉴定，以确保其正确性和完整性。
常用的鉴定方法有限制酶切鉴定、测序验证、PCR扩增鉴定等。
1. 限制酶切鉴定利用正确的限制酶将质粒进行切割，然后经过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
根据不同的切割模式，可以判断质粒是否正确构建。
2. 测序验证通过测序技术对质粒进行测序分析，确保质粒中的外源基因片段的完整性和准确性。
3. PCR扩增鉴定使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的大小，判断质粒中的目标基因是否存在。
【课后集训】第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具(含答案详解)
2019版生物选择性必修3 课后集训第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具题组一基因工程的概念及诞生和发展1．下列叙述符合基因工程概念的是()A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的大肠杆菌菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上2．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是()A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据D．基因工程必须在同物种间进行题组二限制酶和DNA连接酶3．根据下图判断，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是()A．限制酶可以切断a处B．DNA聚合酶可以连接a处C．解旋酶可以使b处解开D．DNA连接酶可以连接c处4．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是()A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DNA连接酶的作用位点是b处D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段5．有关DNA重组技术的工具酶的叙述，正确的是()A．限制性内切核酸酶能切割烟草花叶病毒的核酸B ．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C ．所有DNA 连接酶都能连接黏性末端和平末端D ．DNA 连接酶和DNA 聚合酶均可用来拼接DNA 片段6．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A ．用限制酶切割一个DNA 分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B ．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的概率就越大C ．限制性内切核酸酶的活性不受温度、pH 等条件的影响D ．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 题组三 基因进入受体细胞的载体7．下列关于基因工程操作工具——载体的叙述中，错误的是( )A ．质粒作为常见的载体，不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B ．作为基因工程的载体，标记基因不可或缺C ．目的基因插入载体时，有特定的插入位点D ．构建重组DNA 分子时需DNA 连接酶和限制性内切核酸酶等8．限制酶Mun Ⅰ和限制酶Eco R Ⅰ的识别序列及切割位点分别是－CA ↓ A TTG －和－GA ↓ATTC －。
重组质粒的构建
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通 过 磷 酸 基 团 与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成 磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的 识别位点（多克隆位 点） ，以便外源DNA的 插入与截取。
多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点
或具备特异的重组 位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选 标记，以区别阳性重组分子 和阴性重组分子，主要有抗 药性基因、酶基因、营养缺 陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得 （2）载体的选择与制备 （3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） （4）重组DNA导入受体 （5）重组体筛选和鉴定 （6）目的基因表达 （7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿 主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平 头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效 率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二 重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。
平末端质粒重组连接时间
平末端质粒重组连接时间平末端质粒重组连接是基因工程领域中常用的一种技术手段，可以将DNA序列的特定片段插入到另一条DNA序列中的指定位置。
这项技术对于基因研究、基因治疗等领域都有广泛应用。
在实际应用中，平末端质粒重组连接的时间通常是一项关键指标，下面将从步骤、时间等方面详细介绍。
一、平末端质粒重组连接的步骤1.选取质粒和DNA片段，理论上，这两者的长度应该相等，且端部具有互补性;2.通过酶切将质粒和DNA片段末端线性化，制备末端均为平末端的DNA片段;3.使用足够的浓度的T4DNA聚合酶，将质粒DNA和DNA片段进行混合;4.加入链接试剂，如ATP、 T4DNA连接酶，通过一定的反应条件下，使得持有互补端结构的DNA聚合在一起;5.加入靶细胞，并在特定的温度和环境条件下，使连接后的质粒与靶细胞进行转染。
二、平末端质粒重组连接的时间平末端质粒重组连接的时间是由以上五个步骤中的后三个步骤决定，即加入链接试剂、反应条件和转染时间。
这些步骤都是非常关键的，它们直接关系着连接的效率和质量。
1.加入链接试剂的时间加入链接试剂是整个连接过程中的一步关键步骤，如果加入太早或太晚，都会影响连接效率和质量。
一般来说，加入链接试剂后需要反应至少30分钟，以保证反应的充分完成，从而达到最好的连接效果。
2.反应条件的时间反应条件的时间同样也非常关键，一般来说，反应时间应在30-60分钟之间才能确保连接效率和质量。
不过，这个时间也要视具体情况而定，如果有较多的噪声或其它因素干扰，就需要适当延长反应时间，以达到最佳的连接效果。
3.转染时间的时间转染时间的时间是连接效率和质量的最终决定因素。
一般来说，转染时间应在2-3天之间，以使转染的细胞能够充分的接受连接DNA，从而达到最佳的连接效果。
三、总结平末端质粒重组连接是基因工程领域中广泛使用的一项技术手段，它能够将不同的DNA片段通过连接技术相互拼接。
在连接过程中，加入链接试剂、反应时间和转染时间都是关键的因素，这些因素直接关系着连接效率和质量。
基因工程原理
基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法.docx
DNA连接反应的影响因素&提高平端连接效率的方法&外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应&平端ＤＮＡ连接接反应1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L 的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。
与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。
2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。
有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。
3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。
研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。
例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。
由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。
含有ATP的缓冲液应于 -20℃保存，溶化取用后立即放回。
连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。
与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。
4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。
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［ 摘要 ］ 目的 ： 拼接 Ｄ Ａ片段 并克隆。方法 ： Ｔ Ｎ Ｎ 用 ４Ｄ Ａ连 接酶将 Ｄ Ａ片段 以平末端随机连接 ， Ｎ 随后用限制性 内切
酶 切 割 ， 脂 糖 电泳 分 离酶 切 产 物 ， 选 特 定 片段 纯 化 回 收 ， 线 性 化 的载 体 质 粒连 接 ， 化 大 肠 杆 菌感 受 态 细 胞 。 琼 挑 与 转
研 究报 告
Байду номын сангаас
平末端 Ｄ Ａ随机连接构建 重组质粒 Ｎ
查 向东 ， 刘杨 ， 吴敌 ， 颖虎 ， 卢 梁琳 ， 陈青 峰
１ 徽 大 学 生命 科 学 学 院 ， ．安 安徽 合 肥 ２ ０ ３ ；２ ３０ ９ ．解放 军 电 子 工程 学 院 门诊 部 ， 徽 合 肥 ２ ０ ３ 安 ３０２
［ 图分 类 号 ］ Ｑ ８ 中 ７
［ 献标识码］ Ａ 文
［ 章 编 号 ］ １０ — ０２２ １）１０ ０ — ３ 文 ０ ９ ０ ０ （０ ２０ — １９ ０
Ｃｏ ｓｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ａ ｍ ｉ ｓ ｂ ｎ ｏ ｇ ｔ ｎ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｆ Ｒｅ ｏ ｉ ａ ｔ Ｐｌｓ ｄ ｙ Ｒａ ｄ ｍ Ｌｉ ａ ｉ ｏ ｏ ｕ ｔ Ｅｎ ｅ ｆ Ｂｌ ｎ － ｄ ｄ ＤＮＡ Ｚ Ａ Ｘ ａｇ Ｄ ｎ ＬＵ ｌ ，ＷＵ Ｈ ｉ － ｏｆ ， Ｉ ， ｎ 吼 Ｌ ｉ － ｕ Ｌ Ｎ ｉ ， Ｈ Ｎ Ｑｎ－ ｅ Ｕ Ｙｎ Ｈ １ Ｉ Ｇ Ｌｎ Ｃ Ｅ ｉ Ｆ， ｇ ， Ａ ｇ
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结果 ： 通过 以上 步骤 ， 成功拼接 了不同 Ｄ Ａ片段， Ｎ 构建 了含有 目的拼接片段的重组质粒。 结论 ： 该方法简便 、 易行 、 可
靠， 可作 为 拼 接 、 隆 Ｄ Ａ 的 备 选 方 案 ， 分 子 生 物 学 研 究 和 基 因工 程 中应 用 。 克 Ｎ 在 ［ 键 词 ］ 平 末 端 Ｄ Ａ； 机 连 接 ； Ｎ 关 Ｎ 随 Ｄ Ａ拼 接 ； 因克 隆 基
生 技 术 通 讯 … Ｌ １Ｔ Ｓ Ｉ Ｂ ＯＴ ＨＮＯＬ Ｅ １ＥＲ Ｎ Ｉ ＥＣ Ｔ Ｉ ＯＧＹ Ｖ ｌ ３ Ｎｏ１ Ｊ ｎ，２ １ ｏ 一 ２ ２ ． ２ ． ａ． ０ ， Ｕ
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