牛共刺激分子CD80和CD86实时荧光定量RT_PCR检测方法的建立与应用(1)

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1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

981型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用曾维欢1，2，李　蓉1，2，肖望成1，2，康京丽2，黄保续2，吴发兴2，代飞燕1（1.云南农业大学，云南昆明　650201；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032）摘　要：为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的通用RT-PCR 方法，根据GenBank 上收录的64株1型、2型BVDV 以及1株猪瘟病毒（CSFV ）的全基因组序列，应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR 区域的1型、2型BVDV 特异性通用引物对，扩增目的片段，并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。

结果显示：扩增的目的片段长度约为302 bp ；该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL ，无非特异性扩增，且重复性良好。

对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测，发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV 阳性，随机抽取4份阳性样品送测序，发现3份样品毒株为1型BVDV ，1份样品还需进一步鉴定。

本研究建立的RT-PCR 方法可实现对1型、2型BVDV 核酸的特异性检测，也可用于该病的流行病学调查研究。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；基因1型；基因2型；RT-PCR 中图分类号：S852.65 文献标识码：B 文章编号：1005-944X （2021）02-0098-06DOI ：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.02.019 开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Establishment and Application of a General RT-PCR Assay forDetection of BVDV Type 1 and 2Zeng Weihuan 1，2，Li Rong 1，2，Xiao Wangcheng 1，2，Kang Jingli 2，Huang Baoxu 2，Wu Faxing 2，Dai Feiyan 1（1. Yunnan Agricultural University ，Kunming ，Yunnan 650201，China ；2. China Animal Health and Epidemiology Center ，Shandong 266032，China ）Abstract ：In order to establish a general RT-PCR assay to rapidly detect bovine viral virus （BVDV ）type 1 and 2，the general primer was designed based on 5'UTR sequences of BVDV type 1 and 2 by Primer 6.0 software according to the analysis of complete gene sequence of 64 strains of BVDV type 1and 2 and one strain of classical swine fever virus （CSFV ）registered in GenBank ，and the target fragment was ampliﬁed ，then the speciﬁcity ，sensitivity and reproducibility of the RT-PCR method were evaluated ，and the clinical samples were tested. The results showed that the amplified target fragment was about 302 bp ；the detection limt of the method was 2.09×102 copies/μL ，with no nonspeciﬁc ampliﬁcation but good reproducibility. 13 nasal swabs and 9 bovine serum samples collected from an infected farm in Shandong Province were detected by the established method ，it was found that 8 nasal swabs and 8 sera were positive against BVDV ，then 4 of the positive samples were randomly selected to carry out virus gene sequencing and comparison ，it was found that virus of 3 samples could be identiﬁed as BVDV type 1，and the other 1 sample still needed further analysis. In conclusion ，speciﬁc detection of nucleic acids of BVDV 1 and 2 could be realized by the RT-PCR assay established in the study ，which could also be used in epidemiological investigation of BVDV .Key words ：BVDV ；genotype 1；genotype 2；RT-PCR 收稿日期：2020-11-15　修回日期：2021-01-06同等贡献作者：曾维欢，李　蓉通信作者：吴发兴。

牛病毒性腹泻病毒内标双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

通用型内标双重ＲＴ— ＰＣＲ检测方法，该方法可以监测ＲＮＡ提取与ＲＴ— ＰＣＲ反应过程，指示假阴性结果的
发生。该方法的检测灵敏度约为１００ＴＣＩＤ５。／ｍＬ，且具有较好的特异性和可重复性。通过对５６６份临床样
摘要：为了对ＢＶＤＶ－１和ＢＶＤＶ－２进行同步检测，针对不同基因型牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）基因
组高度保守的５，＿ＵＴＲ核苷酸序列设计特异性引物（扩增长度为２８８ｂｐ）。为了指示假阴性结果，以牛ＧＡＰＤＨ基因为内标基因，设计特异性引物（扩增序列长度为１５２ｂｐ）。通过反应条件的优化，建立了ＢＶＤＶ
中图分类号：￥８５２．６５９．５；Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１４）０１ — ００１７ — ０５
牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉ —
Ｃ２４Ｖ标准毒株种毒、大肠埃希菌ＤＨ５ａ菌株、牛疱
疹病毒１型、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒核酸（从传代细胞中提取）保
存于新疆出入境检验检疫局技术中心实验室；ＭＤ－

牛肉中疯牛病特殊风险物质荧光RT-PCR检测方法的建立

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007,15(5):752~756*基金项目：国家科技奥运专项（No.207001000560716)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.研究员,主要从事进出口动物检疫工作和疯牛病研究。

Tel： 861058619200； Fax:861058619201;Email:<magp@>.收稿日期： 20070207接受日期： 20070404·研究论文·牛肉中疯牛病特殊风险物质荧光 RTPCR检测方法的建立*史喜菊, 马贵平 **, 李冰玲, 杨金良, 王宇,刘旭辉, 李炎鑫, 刘全国（北京出入境检验检疫局，北京 100026）摘要：建立了检测牛肉中疯牛病特殊风险物质（主要是中枢神经组织）标记物胶原纤维酸性蛋白（）mRNA的荧光 RTPCR检测技术。

结果表明，该技术具有良好的种属特异性和组织特异性，只能从牛源和羊源的中枢神经组织中检测到 GFAP，猪源和禽源检测结果为阴性，而且只有脑和脊髓等中枢神经组织产生阳性反应，其它内脏组织以及不同部位牛肉检测结果均为阴性；敏感性检测结果表明，该方法最低检测限达到 0.001%以下；稳定性试验结果表明， 100 ℃加热处理 30min对检测结果无明显影响，中枢神经组织在30 ℃以上室温可以稳定存放 4d，在 4 ℃可以稳定冷藏 2周，检测结果仍然为阳性。

所建立的荧光 RTPCR技术用于牛肉中疯牛病特殊风险物质的检测具有特异性强、敏感性高、稳定性好、快速方便等优点，适合于在日常检测工作中推广使用。

关键词：疯牛病;风险物质；荧光 RTPCR；牛肉中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号:10061304(2007)05075205Detection of Bovine Central Nervous System Tissue as Bovine SpongiformEncephalopathy Specified Risk Material in Beef by Real Time RTPCRSHI Xiju,MA Guiping**,LI Bingling,YANG Jinliang,WANG Yu,LIU Xuhui， LI Yanxin,LIUQuanguoA real time RTPCR detection of bovine central nervous system tissue (CNS)as bovine spongiform encephalopathy （BSE）specified risk material（SRM）in beef and beef products based on glial fibrillary acidic protein( )mRNA was reported. The results showed that the developed method allowed the detection of CNS tissues from bovine and ovine origins,but not from porcine and avian origins,and that the lowest detection limit was below0.001%bovine brain homogenate,and the mRNA sig nal detection was not affected by100 ℃ heating treatment for30min and long period of storage at over30 ℃ room temperature(RT) for4d and at4 ℃ for15d.It is concluded that real time RTPCR based on mRNA can serve as a sensitive and specific test inroutine inspection and quarantine detection for illegal use of bovine CNS tissues in beef and beefproducts.bovine spongiform encephalopathy；specified risk material； real time RTPCR；beef牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopa thy,BSE)，俗称疯牛病，是牛的一种进行性和致死性神经系统疾病（Wells .， 1995）。

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【ＯＭｅｃｔｌｖｅ】Ｔｈｅｒｅｓｅａｌ￣ｈｗａｓａｉｍｅｄｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｒｅａｌ — ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ
速诊断和流行病学调查。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ中圈分类号：￥８５２．６文献标识码：Ａ文章编号：１００１— ４３３０（２０１４）０２— ０３３３— ０７
摘要：【目的】在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）的实时荧光定量ＲＴ— ＰＣＲ检测
方法。【方法】根据Ｇｅｎ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ａｎｋ公布的ＢＶＤＶ５端非编码区（５ＵＴＲ）核苷酸序列，软件分析后设计特异性扩增
—
ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｒａｐｉｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏ
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＣｂ；，Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ８３２０００，；Ｃｈｉｎａ；２．ＢａｙｉｎｇｏｌｉｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌａｎｄＴｅｃｈｎｃｉａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｏｒｌａ，ＢａＹｉｎＧｕｏＬｅｎｇＴｅｃｈｏｌｎｏｇｙＣｏｌｌｅｇｅ，ＫｕｅｄｅＸｉｎｊｉａｎｇ，８４１０００，Ｃｈｉｎａ）

牛病毒性腹泻病毒通用型RT-PCR检测方法的建立

毒Ｉ型、传染性鼻气管炎、瘟病毒、舌病病毒、牛猪蓝口蹄疫病毒、Ｂ细胞作对照，果均为阴性；对新疆各地ＭＤＫ结并
州的样品进行检测。优化反应条件后，测其灵敏度为１～Ｉ／检０ＴＣＤ。ｍＬ。经对４０份临床样品检测，性检出率０阳为ｌ．７，显高于ＥＩＡ检测。试验表明，方法具有特异、敏、效、速、复性好等特点，用于牛病毒Ｏ５明ＬＳ该灵高快重可粘膜腹泻病的临床检测及流行病学检测。关键词：牛黏膜腹泻病毒；５｜Ｒ；一步法Ｒ — Ｃ，ＵＴＴＰＲ；检测
ｓｒｉｗｅｅｗｅｅａｐｉｉｄｒｓｃｉｅｙｂｙｏ — ｔｐＲＴ— ｔａｎｓｒｒｍｌｆｅｅｐｅｔｖｌｎｅｓｅＰＣＲ。ｈｅＰＣＲｒｕｃｓｇｌｔｐｏｄｔｅｗｅｅｒｃｅｅｖｎｒｅｏｖｒｄｅｅｗｉｈｔｔｈｅｐＭＤ１一ｂｙＰＣＲ，ｅｔｉｔｏｎｅｚｍｅｄｉｓｉｎｂｎｄｒｏｒｃｓ２Ｔ８ｒｓｒｃｉｎｙｇｅｔｏａｓｗｅｅｃｒｅｔａ８８ｂｐ．ｅｕｅｉｅｕｔｓｑｎｃｎｇｒｓｌｓ
ｍｏｏａｉｅｓｉｕｙｅＩ，ａｔｅｔｅｔｙｔｅｉｅｒｍｅｓｗｅｅｄｓｇｅｙＢｏｉｅＶｉａａ— ｃｓｌｄｓａｅｖｒｓｔｐ Ⅱ ｎｉｎ，ｈｗｏｓｎｈｓｚｄｐｉｒｒｅｉｎｄｂｖｎｒｌＤｉｒｇ

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR_GreenΙ_实时荧光定量PCR_检测方法的建立与初步应用

·简报·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了建立牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV ）的快速定量检测方法，本研究针对IBRV 基因组gD 序列保守区域设计特异性扩增引物，扩增的目的片段大小为105 bp ，将其克隆至pMD18-T 载体，构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV ，优化反应体系后，建立了快速检测IBRV 的SYBR Green I 荧光定量PCR 方法。

该方法特异性较强，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）、牛冠状病毒（BCoV ）、牛副流感病毒3型（BPIV3）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV ）均无交叉反应；敏感性试验结果显示，该方法敏感性高，对重组质粒标准品的最低检出限达4.8×100 copies/μL ，高于常规PCR 方法；批内、批间重复性试验的变异系数均小于2%，表明该方法重复性良好；该方法检测的样本阳性率高于常规PCR 方法，利用该方法检测牛场送检的106份临床样品，结果显示IBRV 的阳性率为36.7%，常规 PCR 检测方法检测显示阳性率为33.0%，二者符合率为96.2%，表明该方法更适用于临床样品检测。

本研究建立的IBRV 的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、快速高效，对于IBRV 的检测和流行病学调查具有重要意义。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；检测方法；gD 基因；实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码： B文章编号：1674-6422（2023）06-0140-06Development and Preliminary Application of the SYBR Green I Real-time Fluorescent Quantitative PCR Method for Detection of I nfectious BovineRhinotracheitis VirusWANG Qianying 1, YANG Sen 1, LIU Kexin 1, WANG Chao 2, SUN Feiyan 1, ZHANG Shuqin 1(1. Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China; 2. Heilongjiang Journal Press of Agricultural Science and Technology, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China)收稿日期：2021-08-31基金项目：吉林省重点研发项目（20220202058NC）；国家自然科学基金（31602093）；基本科研业务费（1610342018004）作者简介：王倩颖，女，硕士研究生，主要从事病毒分子生物学研究通信作者：张淑琴，E-mail：***********************牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 检测方法的建立与初步应用王倩颖1，杨森1，刘可欣1，王超2，孙飞雁1，张淑琴1（1.中国农业科学院特产研究所，长春130112；2.黑龙江省农业科学院黑龙江农业科技杂志社，哈尔滨150086）2023,31(6):140-145Abstract: To develop a rapid and quantitative assay for detection of Infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV)in this study, speciﬁ c ampliﬁ cation primers were designed based on the conserved region of gD sequence of IBRV genome and an ampliﬁ ed target fragment of 105 bp in length was ligated into pMD18-T vector ton construct the recombinant plasmid standard pMD-gD-IBRV . Subsequently, the SYBR Green I real-time ﬂ uorescence quantitative PCR method was optimized for its reaction parameters and ready for rapid detection of IBRV . The assay was highly speciﬁ c and had no cross reaction with Bovine viral diarrhea virus (BVDV), Bovine coronavirus (BCoV), Bovine parainﬂ uenza virus type 3 (BPIV3) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV). The assay also showed high sensitivity with a minimum detection limit of 4.8×100 copies/μL for the recombinant plasmid standard, which was 100 times more sensitive than that of the conventional PCR method. The coefﬁ cients of variation between intra assay and inter assay were less than 2%, indicating that the method· 141 ·王倩颖等：牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR 检测方法的建立与初步应用第31卷第6期牛传染性鼻气管炎（i n f e c t i o u s b o v i n e rhinotracheitis, IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）引起的一种常见的牛呼吸道传染病，该病呈现出热性、急性、接触性的特点，主要临床症状表现为呼吸道症状如鼻炎、流鼻涕、呼吸困难、发热等，易造成鼻腔及气管上纤毛及粘膜的损伤，严重时可感染肺泡内的巨噬细胞，进而削弱呼吸道的防御机制[1]。

2020年《中国奶牛》杂志第1~12期总目次

TOTAL CONTENTS2020·122020年《中国奶牛》杂志第1～12期总目次（括号内圆点前为期数，后为页数）★特别关注请勿谈“冠”色变 ——人和动物冠状病毒的那些事……………祁明普，郭爱珍，等（2.1）关于当前人间新型冠状病毒肺炎疫情防控对我国养牛企业生产影响及其应对措施建议………………………………………郭爱珍，彭清洁，等（2.5）新冠肺炎防控形势下湖北奶业生存现状及其对策……………………………… ………………………………………………………滑国华，梁爱心，等（2.9）产业链视角下我国干酪产业的发展与建议………………张健，杨贞耐（3.1）细数牛奶中的免疫活性蛋白……………………………丁芳，王丽，等（3.5）★奶业要闻2020中国奶业20强（D20）峰会在石家庄市隆重召开 ……………………… ……………………………………………………………张维维，张芳（10.1）第十一届中国奶业大会暨2020中国奶业展览会于石盛大召开 ……………… ……………………………………………………………张芳，范云琳（10.4）★科学研究重组酶聚合酶扩增技术及其在牛病原检测中的应用…李天芝，于新友，等（3.8）挤奶厅气载大肠杆菌的分离鉴定及其REP-PCR指纹图谱分型研究 ………… …………………………………………………………钟召兵，王宁，等（4.1）妊娠失败牛外周血中干扰素刺激基因和细胞因子的表达分析………………… ……………………………………………………………余婕，程蕾，等（5.1）调控乳蛋白合成信号通路的研究进展……………汪东阳，谢月琴，等（5.6）牛共刺激分子CD80、CD86 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立 ……………………………………………………………………唐颖，邓宇（6.1）转录组中LncRNA在牛上的研究进展 ………………龚龑，刘士钊，等（9.1）大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB信号通路的影响 ………………… ……………………………………………………姜烨琪，张瑞真，等（10.9）一株乳源蜡样芽孢杆菌肠毒素基因克隆与序列分析…………………………… ………………………………………………………陈玉娟，赵瑶，等（11.1）★饲料饲养γ-氨基丁酸在缓解奶牛热应激上的应用前景 ………刘岩，杨光，等（1.1）日粮添加裂壶藻粉对奶牛生产性能和乳品质的影响…………………………… ………………………………………………………苏世灿，王建烽，等（1.5）解决当前我国奶牛蛋白饲料资源紧缺的方法与建议…………………………… ……………………………………………………李思妍，王建发，等（1.10）植物甾醇对奶牛生产性能、血液胆固醇和抗氧化能力的影响…………………………………………………………………………谢颖，金志红，等（2.12）不同降温处理工艺对北京地区奶牛夏季生产性能和生理指标的影响…………………………………………………………………孙越，直俊强，等（2.19）高效液相色谱法测定过瘤胃赖氨酸盐酸盐的含量…赵威，徐振兴，等（2.25）玉米果穗裹包青贮饲料研究……………………张红梅，刘铁军，等（3.11）葵花籽粕的营养特性及在反刍动物上的应用…金宜全，杨志强，等（3.14）玉米与红薯秧混合青贮品质研究…………………………………苏传琛（4.5）液态发酵饲料对奶牛产奶性能、血清抗氧化能力及血液生化指标的影响………………………………………………………………杨小兵，赵超，等（4.9）犊牛初乳饲喂及管理指导…………………………白雅芳，张楠，等（5.12）不同补喂剂量的精料补充料对新疆褐牛犊牛生长发育的影响………………… ……………………………………翟卫爽，古丽孜阿依·司马依，等（5.15）饲料添加剂在犊牛日粮中的应用……………………曾浩南，李政，等（6.6）酸化乳饲喂犊牛对其生长发育的影响…………郑蒙蒙，李国忠，等（6.11）短链脂肪酸促进犊牛瘤胃发育的作用机制…………范雪，马健，等（6.14）采食对荷斯坦牛两种异常口部行为的影响及其日变规律……………………… ………………………………………………………赵卿尧，孙福昱，等（7.1）鲜奶饲喂量对中国荷斯坦犊牛生长发育、血液生化指标和养分消化的影响……………………………………………………………郑会超，黄新，等（7.7）环境温度应激对奶牛的影响……………………杨志强，刘李萍，等（7.13）有机微量元素在奶牛不同生理阶段中的作用研究进展…………王晓佳（8.1）奶牛热应激情况下脂肪酸营养调控研究进展………林聪，杨玉琪，等（8.5）过瘤胃包被壁材的研究进展………………………………符运斌，刘博（8.9）大理地区几种青贮牧草产量及营养成分评价分析…张晓燕，高景舜，等（9.6）奶牛躺卧行为简要分析 ……………………………曹斌斌，郭栋，等（9.10）后备奶牛饲养管理关键点………………………祁敏丽，彭传文，等（9.13）奶牛场优质高效安全体系的建立与实施效果分析 …韩广文，张书义，等（10.12）奶牛肢蹄病的危害及营养调控技术最新研究进展邢小光，徐鸿润，等（10.15）草地贪夜蛾虫害的饲料应对措施………………邓嘉杰，姚鸿钦，等（10.20）两种固体钙制剂对荷斯坦牛产后血液离子钙水平的影响……………………… ……………………………………………………张成喜，王清新，等（10.24）牛至油促进动物生长的作用机制研究…………高春柳，王建发，等（11.8）苜蓿青贮品质评定研究进展 …………………罗润博，张养东，等（11.12）不同磷水平日粮对奶牛生产性能和磷排放量的影响…………………………… …………………………………………………………红敏，高民，等（11.17）热应激下牛舍环境变化及牛床喷雾应用探讨 …曹斌斌，胡双峰，等（12.1）添喂5-羟基色氨酸、过瘤胃5-羟基色氨酸对奶牛产奶量及血浆激素水平的影响……………………………………………曾福祥，王丽，等（12.5）通过灰色关联度综合评价筛选饲用高粱的引种最适品种和最佳收获时间…………………………………………………………史威威，徐玉青，等（12.10）★繁殖育种加拿大LPI指数修订对中国奶牛选育工作的启示 ……范强，孙亚波（1.15）牛活体采卵技术研究进展…………………………姚顺，赵明礼，等（1.19）大通牦牛DQA2基因CDS区序列分析 ……………陈朗，彭帅，等（2.29）63TOTAL CONTENTS2020·12奶牛生长性状研究进展与展望…………………………麻柱，李艳华（2.34）奶牛流产现状分析………………………………郭启勇，柳国锁，等（2.38）影响荷斯坦牛产奶量差的因素分析…………………张强，梁艳，等（3.18）国家奶牛核心育种场建设现状及建议……………李姣，刘光磊，等（3.24）不同剂量生殖激素对小鼠超排效果的影响……田风林，宋学功，等（3.27）牛早期胚胎取样对移植妊娠率的影响…………蔺惠良，苏硕青，等（4.13）西南某规模化奶牛场全年繁殖效率及其影响因素……………………………… ……………………………………………………陈婷婷，刘文娇，等（4.17）荷斯坦牛HH5遗传缺陷基因快速检测方法的建立及应用 …………………… ……………………………………………………孙愉洪，王铭正，等（5.18）奶牛胚胎早期死亡的转录组初探…………………吕小青，刘林，等（5.23）荷斯坦牛妊娠天数影响因素分析………………王晓佩，王晓锋，等（5.26）犊牛初生重分布及其对母牛助产率的影响分析………………………………… …………………………………………………薛雅之，吐日根白乙拉（6.18）江苏某发酵床养殖奶牛场日产奶量和体细胞评分影响因素分析………………………………………………………………………周部，刘雨吉，等（6.21）奶山羊羔羊成活率现状分析及建议……………边会龙，史怀平，等（7.17）BioPRYN 酶联免疫方法检测牛早孕的应用研究 …解鑫，马文丽，等（7.23）奶牛TLR4基因编码区生物信息学分析 …………高成宏，文亮，等（8.13）种公牛阴茎纤维乳头状瘤的危害及防治………焦子康，王利利，等（8.16）牛OPU卵子体外受精和早期胚胎培养的方法研究 …………………………… ………………………………………………………王志仙，朱宏波，等（9.16）本地西杂牛与德系西门塔尔牛杂交的F1代、F2代公牛生长规律研究 ……… ……………………………………………………李春芳，和利民，等（9.20）北京与上海地区中国荷斯坦牛长寿性及淘汰原因分析………………………… …………………………………………………………彭朋，杨影，等（9.23）河南省种公牛站发展现状、存在问题及对策…………………王献伟（10.28）A2纯合基因型荷斯坦牛选育技术研究 ………蒋桂娥，赵利梅，等（10.31）陕西奶山羊良种繁育体系建设思考………………王鹏飞，陈帅，等（10.34）归芎益母散对血瘀型胎衣不下奶牛生殖激素和抗氧化能力的影响…………………………………………………………………黎玉琼，黄雪利，等（11.22）热应激对种公牛精液质量影响及应对策略………王彦平，常卓，等（11.26）早期监测与预警在奶牛繁殖中的应用…………刘海萍，杨志强，等（11.30）定时人工授精后通过不同方法增加P4浓度对奶牛妊娠率的影响 ……………………………………………………………………张萌，和东迁，等（12.14）河南省牛羊种业现状、存在问题及未来发展思考……………………………… ……………………………………………………王献伟，黄永震，等（12.18）与奶牛乳脂及乳蛋白合成有关的候选基因研究进展…………………………… ……………………………………………………吕小青，杨宇泽，等（12.22）★奶牛保健2018年进口奶牛检疫情况分析 ………………窦树龙，季新成，等（1.24）奶牛副结核病流行牛场的处置方案分析………吴建勇，杨学云，等（1.28）新饲养模式下奶牛异物性肺炎的病理剖检变化及防控研究…侯引绪（1. 33）奶牛皱胃右方变位的手术整复方法……………赵永会，李淑艳，等（2.41）青海省部分规模化奶牛场乳房炎主要病原菌调查分析………………………… ………………………………………………………王军，陈广宏，等（2.45）牛轮状病毒研究进展………………………………贾伟强，曲庆，等（2.49）中西医结合治疗奶牛焦虫病……………………李四焘，张合岗，等（2.53）荷斯坦牛血液中矿物质含量与常见疾病发病关系的研究……………………… …………………………………………………………张泰彪，朱新荣（3.30）致奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及防治建议………………………… ……………………………………………………张保海，罗正中，等（3.33）中药防治奶牛乳房炎的研究进展…………………刘昊，曹凯捷，等（3.37）云南建水地区2017-2019年牛羊布鲁氏菌病的流行病学调查分析 ………… ……………………………………………………张小苗，周玉照，等（3.40）奶牛场无乳链球菌传播途径新发现…………………骆巧，吕倩，等（4.22）新疆地区某规模化牛场荷斯坦牛发病情况分析 …赵俊亮，赵番番，等（4.25）一例支原体和大肠杆菌混合感染奶牛乳房炎的诊断…………………………… ………………………………………………………刘琴，张泉鹏，等（4.29）BVDV在牛、羊之间的传播及预防 ……………王建东，李艳艳，等（5.29）一例夏南牛大肠杆菌与链球菌混合感染的病例报告…………………………… ………………………………………………………刘心，彭清洁，等（5.32）奶牛隐孢子虫虫种和基因型的国内研究进展………黎巧，肖冉，等（6.26）新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究……………………………… ………………………………………………………薛新梅，齐萌，等（6.30）牛源无乳链球菌的耐药率调查及其耐药机制研究进展………………………… ………………………………………………………李明，赵艳坤，等（6.34）奶牛乳房炎研究进展及国内防治现状思考……………………张俊杰（7.26）一起规模奶牛场犊牛腹泻病的病原学诊断………覃杰，宫国令，等（7.31）新疆石河子地区牛结核病检测方法的比较研究………………………………… ……………………………………………………王宏伟，李新萍，等（7.33）上海地区奶牛“两病”净化关键技术及模式探索……………………………… ……………………………………………………叶耿坪，刘光磊，等（7.36）中国部分规模化牧场奶牛低血钙现状调查分析………………谢心美（8.19）奶牛乳房炎抗生素替代疗法的研究进展…………………………周曼（8.23）新疆石河子地区某牧场致奶牛乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验………………………………………………………………马博，卜三平，等（8.28）不同碘络合物药浴液对奶牛乳头健康及牛奶体细胞数的影响研究………………………………………………………………司马博锋，花月平，等（8.33）山楂对围产期奶牛肝功能和血脂的影响………毛桂芸，张永飞，等（8.36）2019年进口奶牛检疫情况分析 ………………窦树龙，江红旗，等（9.28）上海地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析………………………… ………………………………………………………朱宁，赵艳坤，等（9.31）某奶牛场犊牛腹泻的病原诊断及防控建议………刘伯承，王慧，等（9.36）西宁市牛衣原体病流行病学调查………………王淑琴，张成图，等（9.40）牛结核病流行现状与诊断技术研究 …………李少晗，崔尚金，等（10.38）早期预警在奶牛疾病中的应用 ………………杨玉琪，刘李萍，等（10.42）蓝舌病病毒非结构蛋白研究进展…………………赵瑶，易华山，等（10.45）牛奶体细胞分型指数变化规律研究………………安朋朋，孙健，等（10.50）青海农区育肥牦牛疾病调查与综合防控对策………张玉芳，蔡相银（10.55）奶牛场变形蹄及蹄病数据分析…………………崔文昊，孙德孝，等（11.34）山西规模牛场奶牛乳房炎发病情况调查………韩文儒，杨丽华，等（11.38）新兽药酮洛芬的研究开发及临床应用进展……寇贺红，焦晓军，等（11.41）某规模化牧场致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的鉴定及耐药性分析…………………………………………………………………甘卫泽，李益涛，等（11.45）甘肃省武威市凉州区奶牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查与分析…………………………………………………………………………王衡，满海燕（12.26）兽医日常工作给奶牛带来的应激影响及缓解措施……………黄荣春（12.29）河南省某肉牛屠宰场牛支原体感染情况调查…徐引弟，焦文强，等（12.33）芍药甘草汤治疗奶牛卧地不起综合征案例…………范占炼，陈志良（12.36）64TOTAL CONTENTS2020·12★机械设施DG/T 082-2019《粪污固液分离机》推广鉴定大纲解读 ……………………… ……………………………………………………………杜金，陈立丹（1.36）DG/T 086-2019《畜禽尸体处理机》推广鉴定大纲解读 …陈立丹，杜金（3.55）DG/T 148-2019《有机废弃物好氧发酵翻堆机》推广鉴定大纲解读 ………………………………………………………………………杜金，陈立丹（4.55）传送带式饲喂系统在规模化奶牛场的应用………………………王波（5.35）农业滴灌设备流量一致性测试方法探讨…………………冯健，李民（5.39）畜牧养殖机械推广鉴定技术体系研究…………………………王明磊（8.52）自走式青饲料收获机噪声测定结果影响因素分析……冯健，刘德普（9.54）德国畜禽粪污资源化利用政策与技术装备研究 …刘声春，王桂显，等（9.57）打捆机捡拾宽度实验室间比对研究………………刘辉，王明磊，等（10.67）信息化技术在奶牛生产中的应用……………………王云，芦娜，等（11.61）基于双目立体视觉的挤奶机自动奶杯套杯技术研究…………………………… ……………………………………………………李小明，杨开锁，等（12.42）★乳与乳制品不同食物源中乳酸菌的分离及酸奶发酵性能研究郑天宇，彭帅，等（1.43）动物双歧杆菌A6体内外安全性评价 ……………周晓娟，桑跃，等（1.48）葡萄汁奶酒发酵工艺研究………………………林少华，李星宇，等（2.55）模糊数学评判法在大麦若叶牛奶研制中的应用…孙记涛，郑阳，等（2.60）抹茶椰子乳饮料制作工艺的研究…………………………杨洋，高航（3.44）发酵牦牛乳蛋白肽的分离纯化及抗氧化活性研究……………………………… ……………………………………………………魏光强，李华瑞，等（4.32）牛奶酒酿造过程中微生物多样性的动态变化…林少华，贾红亮，等（4.39）凝固型酸奶仪器检测指标与感官指标间的相关性研究………………………… …………………………………………………………郭奇慧，雷守成（5.42）生鲜乳中芽孢杆菌的危害与控制措施……………李建洲，邵伟，等（5.47）双歧杆菌生物特性及其功能研究进展……………李吉平，陈雪，等（6.57）中美第一阶段经贸协议中几种乳制品及其工艺分析…………………………… ……………………………………………………郭利亚，顾佳升，等（7.39）动物双歧杆菌NMC对小鼠溃疡性结肠炎的预防作用 ………………………… ……………………………………………………姜岩世，张永祥，等（7.43）副干酪乳杆菌YLZB对小鼠免疫的调节作用 …姜岩世，张永祥，等（8.40）枸杞姜撞奶的工艺研究………………………………钱旺，丁波，等（8.44）应用于婴幼儿配方奶粉中油脂的对比分析……粘靖祺，王青云，等（8.48）发酵牦牛乳菌种筛选及加工工艺优化……………杨婧，郑娴余，等（9.44）花生牛奶饮料原料配比优化及加工工艺的研究………李伟，辛跃珍（9.50）植物乳杆菌FEED8对小鼠抗氧化作用的研究 …闫刘慧，王小鹏，等（10.59）乳制品减糖方案研究进展…………………………王鑫，许凤莲，等（10.63）软质干酪生产工艺研究………………………………辛跃珍，刘淑玲（11.49）牛奶免疫调节及预防慢性基础病作用简述………王鑫，许凤莲，等（11.53）牛奶浓缩蛋白的加工制备、特性及其应用研究进展…………楼盛明（12.39）★质量安全提高液相色谱固相萃取柱使用效率的可行性研究……………辛跃珍（1.40）离子色谱法测定生乳中硫氰酸根的方法研究 …叶巧燕，高亚男，等（4.49）液体乳产品加工过程质量控制浅谈……………………………辛跃珍（6.62）离子色谱法同时测定生鲜乳中碘离子、硫氰酸根离子………………………… …………………………………………………………李征，黄骅，等（7.47）乳中硫氰酸钠检测方法研究进展……………………张宁，周鑫，等（9.62）★DHI专栏应用MIR预测牛健康状况的研究进展 ……陈焱森，上官爱哨，等（1.58）基于DHI数据浅谈石河子地区奶牛酮病发病情况及预防措施 ……………… ………………………………………………………高天乐，徐烨，等（1.64）天津地区奶牛生产性能测定（DHI）工作现状 …夏敏，赵庆彬，等（3.48）利用DHI奶样检测孕酮的可行性分析 …………邹杨，娄文琦，等（3.51）防腐剂对DHI检测指标及防腐效果的影响 ……高天乐，徐烨，等（4.44）黑龙江省规模化奶牛场副结核病血清学调查 …师庆伟，桑学波，等（7.61）DHI防腐剂不同添加形式对乳品质检测指标的影响 …高天乐，何开兵（8.60）★奶业经济休闲观光牧场的现状、机遇、发展前景及建议………………吴胜军（1.51）十堰市都市型奶业的发展定位和生产方式……张荣兵，曹钟鑫，等（1.54）2019年中国乳业贸易形势与后期展望 ……………何洋，郭杰，等（3.59）从生鲜牛乳监测角度谈宁夏奶产业的发展……高建龙，周海宁，等（3.63）婴幼儿配方乳粉市场需求测算模型应用研究…张书义，祝庆科，等（6.40）2019年山东省奶业发展情况、存在问题及对策建议 ………………………… ……………………………………………………薛光辉，张汝美，等（6.43）筑建可持续低碳经营的中国奶业……………………陈幼春，王雅春（6.47）黑龙江省完达山乳业股份有限公司战略管理研究……………陈仪静（6.51）2019年中国奶业市场分析与未来10年展望 …………………王东杰（7.51）中国奶牛生产布局变迁影响因素分析……………………………崔力航（7.56）荷兰奶业补贴政策对我国奶业振兴的启示………祝丽云，李彤，等（12.46）法国奶业发展现状及与中国合作研究……………王礞礞，张超，等（12.51）山东省奶业发展现状、存在问题与对策建议…胡智胜，李建斌，等（12.55）★管理培训提升牧场自主管理水平，推动奶源基地建设 …时发亿，张巧娥，等（5.53）牧场检测实验室风险管理分析及控制…………………………王小丽（5.59）基于线上教学的乳品检验教学实施报告…………刘倩，孙先枝，等（12.59）★养殖环境保护华北地区规模化奶牛场用水及粪污处理情况调查报告………………………… ………………………………………………………靳爽，李聪聪，等（2.64）我国畜禽粪便资源化利用的现状及展望…………李莉，杨昕涧，等（11.55）★牧草专栏我国东北、西北地区秸秆牧草类饲料资源常规概略养分含量调查报告………………………………………………………………陈志敏，张姝，等（4.59）燕麦在凉山地区不同刈割期草产量分析…………………………何巍（8.56）凉山地区燕麦与光叶紫花苕不同混播比例对生物量影响的研究………………………………………………………………………柳茜，乔雪峰，等（11.64）★信息动态“以牛为先质胜未来” 2020第七届勃林格奶牛论坛在上海成功举办 ………… ……………………………………………………………………本刊讯（9.66）致力挤奶设备创新分析分享奶业最新成果 ——奶业荐新论坛在石家庄国际会展中心成功举办……本刊讯（10.71）65。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。

对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

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中图分类号：Ｓ　８５２．４２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３－４６９６（２０１０）０９－０９５３－０６牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立与应用韩猛立１，２，何延华１，黄　新１，宋天增１，２，薄新文１，钟发刚１＊（１．新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子　８３２０００；２．石河子大学动物科技学院，新疆石河子　８３２００３）摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中牛ＣＤ８０和ＣＤ８６基因的序列，在保守区设计并合成各自的特异引物，并以牛３－磷酸甘油脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）基因为内参，采用ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６的ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ实时荧光定量ＰＣＲ方法。

将ＣＤ８０基因和ＣＤ８６基因克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经ＰＣＲ及测序鉴定后得到阳性重组质粒，作为标准品模板建立ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ荧光定量ＰＣＲ标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。

结果表明，ＣＤ８０基因、ＣＤ８６基因和ＧＡＰＤＨ基因的Ｃｔ值与标准品稀释度在１×１０２～１×１０８　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ范围均呈良好的线性关系，相关系数均大于０．９９１。

熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰，特异性和重复性较好。

证实，所建立的牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法适用于临床样品的检测。

关键词：ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ；实时荧光定量聚合酶链反应；牛；ＣＤ８０；ＣＤ８６Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ＣＤ８０ａｎｄ　ＣＤ８６ｇｅｎｅｓＨＡＮ　Ｍｅｎｇ－ｌｉ　１，２，ＨＥ　Ｙａｎ－ｈｕａ１，ＨＵＡＮＧ　Ｘｉｎ１，ＳＯＮＧ　Ｔｉａｎ－ｚｅｎｇ１，２，ＢＯ　Ｘｉｎ－ｗｅｎ１，ＺＨＯＮＧ　Ｆａ－ｇａｎｇ１（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｈｅｅｐ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＆Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｂｏｖｉｎｅ　ｃｏ－ｓｔｉｍｕ－ｌａｔｅｓ　ｇｅｎｅｓ　ＣＤ８０ａｎｄ　ＣＤ８６，ｔｈｒｅｅ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ（ＢｏＣＤ８０，ＣＤ８６）ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｂｏｖｉｎｅ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＢｏＧＡＰ－ＤＨ）ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｎａ１ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄ－ｕｃｔ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＭＤ１８－Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｑｕａｎ－ｔｉｔａｔｉｖｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ａｎｄ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｃｔｏｆ　ＢｏＣＤ８０，ＣＤ８６ｏｒ　ＢｏＧＡＰＤＨ　ｇｅｎｅｓ　ｈａｄ　ａｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（ｒ２＞０．９９１）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　１×１０２　ｔｏ　１×１０８　ｃｏｐｉｅｓ／μＬ，ａｎｄ　ｔｈｅｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｅａｋ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓ－ｓａｙ　ｃｏｕｌｄ　ｑｕｉｃｋｌｙ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ；ｃａｔｔｌｅ；ＣＤ８０；ＣＤ８６机体对病原体的特异性免疫应答机制十分复杂，涉及抗原递呈细胞对抗原的识别、淋巴细胞的功能及共刺激分子的第二信号等诸多因素［１］。

Ｂ７家族分子是转导共刺激信号的重要分子，主要包括收稿日期：２０１０－０４－０２；修回日期：２０１０－０６－２１基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３）前期研究专项（２００８ＣＢ１１７０１７）；国家自然科学基金项目（３０９６０２８６）；新疆生产建设兵团博士基金项目（２００７ＪＣ１５）作者简介：韩猛立（１９８０－），男，陕西武功人，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｎｍｅｎｇｌｉｍｍ＠１６３．ｃｏｍ。

＊通讯作者，副研究员，博士，硕士生导师，研究方向为病毒分子生物学，Ｔｅｌ：０９９３－６６８３６９７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｆｇ１２５＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ中国兽医科学　２０１０，４０（０９）：９５３－９５８Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　ＳｃｉｅｎｃｅＢ７－１（ＣＤ８０）和Ｂ７－２（ＣＤ８６），与其受体ＣＤ２８组成了第二信号分子，在免疫应答中发挥重要的作用［２］。

ＣＤ８０、ＣＤ８６是表达在ＡＰＣ上的重要的协同刺激分子，两者有相似之处，也有区别，各自在免疫应答中起重要的作用［３］。

Ｔ细胞的活化需要双信号刺激，其中共刺激分子发挥了相当重要的作用。

适宜的共刺激信号可以降低Ｔ细胞活化时对第一信号的需求，缺乏第二信号的活化可使Ｔ细胞无能；抑制性共刺激信号可以减弱免疫反应或导致免疫耐受。

对共刺激分子的深入研究，可以加深对免疫相关性疾病发生、发展机制的认识，从而为临床提供新的免疫治疗途径。

ＲＴ－ＰＣＲ是研究哺乳动物组织中基因表达的有效方法，已成功应用于检测细胞因子的表达［４－５］。

实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）具有敏感性高、重复性好、耗时短、操作简便和无污染等优点，已成为核酸定量检测的首选方法而得到广泛应用［６－７］，在检测猪细胞因子中也有报道［８－９］。

国内也有关于检测猪、鸡、小鼠等细胞因子的相关报道［１０－１７］。

ＣＤ８０和ＣＤ８６是研究得最为广泛的共刺激分子，目前尚未见有关ＣＤ８０和ＣＤ８６荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的报道。

本研究旨在建立一种用于检测牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法，为在ｍＲＮＡ水平研究ＣＤ８０和ＣＤ８６在牛体内的动态表达规律，进一步阐明免疫细胞的增殖活化及免疫调节机制提供有效的技术支持。

１　材料与方法１．１　实验动物和菌种石河子市周边某集约化养殖场临床健康荷斯坦奶牛，大肠杆菌感受态细胞ＤＨ５α由新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室保存。

１．２　主要试剂和仪器Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ购自ＱＩＡＧＲＥＮ公司。

淋巴细胞分离液购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

Ｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉ　Ｋｉｔ购自北京全式金生物技术有限公司。

５００ｂｐ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ购自北京天根生化科技有限公司。

胎牛血清（ＦＢＳ）为武汉三利生物技术有限公司产品。

ＲＰＭＩ　１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ）和ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。

ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ、ＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉ－ｔｏｒ）、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ＯｌｉｇｏｄＴ（１８）、ｐＭＤ１８－Ｔ载体等购自大连宝生物工程有限公司。

Ｍｘ３０００ｐ荧光定量ＰＣＲ仪为Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司产品。

凝胶成像系统ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ　Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅ为美国基因公司产品。

紫外分光光度计ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ＮＤ－１０００为Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮ－ＴＩＦＩＣ公司产品。

１．３　引物的设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ上牛共刺激分子ＣＤ８０和ＣＤ８６的基因序列，在保守区设计了各自的特异引物（引物序列见表１）。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

１．４　牛外周血单核细胞的分离、培养与诱导无菌采取健康荷斯坦奶牛新鲜血液１００ｍＬ（肝素抗凝），利用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞（ＰＢＭＣ），用含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０培养液于３７℃５０ｍＬ／Ｌ的ＣＯ２培养箱中培养，经Ｃｏｎ　Ａ（Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍＬ和ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）５μｇ／ｍＬ刺激２４ｈ后，收集细胞，置于－２０℃保存以检测ＣＤ８０ｍＲＮＡ和ＣＤ８６ｍＲＮＡ的转录情况。

表１　牛ＣＤ８０、ＣＤ８６和ＧＡＰＤＨ基因实时荧光定量ＰＣＲ的扩增引物Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ＣＤ８０，ＣＤ８６ａｎｄ　ＧＡＰＤＨ　ｇｅｎｅｓ基因Ｇｅｎｅｓ登录号Ａｃｃｅ．Ｎｏ．方向Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ引物序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ退火温度／℃Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ产物大小／ｂｐＳｉｚｅＣＤ８０ＸＭ－６１７５４３Ｆｏｒｗａｒｄ　５′－ＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣ－３′Ｒｅｖｅｒｓｅ　５′－ＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＴＴ－３′６０　１３０ＣＤ８６ＢＴ－０２５４２８Ｆｏｒｗａｒｄ　５′－ＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＡ－３′Ｒｅｖｅｒｓｅ　５′－ＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣＧＴ－３′６０　１２４ＧＡＰＤＨ　ＢＴＵ－８５０４２Ｆｏｒｗａｒｄ　５′－ＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＴＣＣＡＣＣＣ－３′Ｒｅｖｅｒｓｅ　５′－ＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＣ－３′５６　６７１．５　总ＲＮＡ的提取与反转录按照文献［１８］的方法和Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒ－ｉｚｏｌ说明书提取细胞总ＲＮＡ。