细胞凋亡荧光检测方法
1. 磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
AnnexinV可以与多种荧光标记链接
Annexin V-Biotin Annexin V-Cy3
Annexin V-Cy5
Annexin V-EGFP
Annexin V-FITC
Annexin V-PE
Annexin V-PE-Cy5
2. 线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123（Ex：507nm；Em：529nm）、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）](Ex：482nm；Em：504nm)、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)、MitoCapturetm（EX:488nm;Em:530nm+30nm）、等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
3. TUNEL法 细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
4. 荧光分析Caspase-3活性Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
细胞凋亡试验常用的方法
威斯腾生物 400-675-6758 细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值） x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。 威斯腾生物 400-675-6758 （四）透射电镜形态学观察法： 收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于10^6个，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%锇酸固定1h，丙酮酸梯度脱水。 细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸橼酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片，呈新月形凋亡小体，并选择典型切片图像摄影。 （五）流式细胞仪检测法： 1、原理： 处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失，仅剩下大分子量DNA片断，这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA含量小于2n的分布区，称“亚G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。 2.特点： 经济简便，仅需单一染色。 可判断凋亡细胞发生于哪一周期。 可定量测定凋亡率，结果客观可信。 用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。 3、方法步骤： 收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于10^6个，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。 染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。 每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭（PI）染液100ul混匀，置4℃避光30min，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。 除上述常用的方法外，还可采用 ELISA法。其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构，再经酶显色也可判断。 末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经酶显色或用荧光抗体显示出来。
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方式及试剂
线粒体膜电位指示染料
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633
MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞
图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。 利用MitoView ™633 染色
图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞 （JC-1 染色）. FL1 (x- 轴)
为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。 (A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明： 由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒
JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光
585/590nm)。相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。通过J C -1 从红色荧光到绿色荧光的转变能够很容易地检测到细胞膜电位的下降，从而能够用于初期的细胞凋亡检测。
AnnexinV-FITC细胞凋亡检测说明书
凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒
一、原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜
中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结
合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结
合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）
标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC
的绿色荧光信号相比，FITC的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用
FITC作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期
的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于
不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份
组份 10 assays 20 assays 50 assays
Annexin V-FITC 10μL 20μL 50μL
2×Binding Buffer 2.5 mL 5.0 mL 15 mL
Propidium Iodide （PI） 50μL 100μL 250μL
三、操作步骤
1． 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；
2． 用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；
3． 吸取250μL的 2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；
4． 用上述500μL的 1×Binding Buffer悬浮细胞；
5． 加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；
TUNEL法检测细胞凋亡
细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。
基因组 DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran
sferase,TdT） 的催化下加上荧光素（FITC）标记的 dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测， 这就是TUNEL
法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的 DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的 DNA断裂
（和细胞凋亡时的断裂方式不同 ）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开 ，另一方面也不会把
射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：
基本原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT和bio标记的dUTP进入细
胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与 dUTP上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合 3个biot in 分子），最后用DAB
过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶 HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕 褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中 TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情
况。■
1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程 中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT En zyme）的
作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的 DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的
链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（ DAB的
存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色） ，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通
tunel 染色原理
tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。
正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读 3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒红色TRITC标记荧光检
一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（红色 TRITC 标记荧光检测法，通用型）
说明书修订日期：2018.07.31
Catalog No.：KGA7061 / KGA7062 / KGA7063
Storage：-20℃ for 12 months,避光
For Research Use Only（科研专用）
一、TUNEL 检测原理
凯基一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(TRITC 红色荧光标记，通用型)提供一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检
测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况，其原理是红色荧光素（Tetramethylrhodamine，TRITC）标记
的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3′－OH 末端，可
用荧光显微镜检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3′-OH 形成，很少能够被标记。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。
二、TUNEL 试剂盒组分
组 份 Cat: KGA7061 Cat: KGA7062 Cat: KGA7063 储存条件
20 assays 50 assays 100 assays
10×Proteinase K 200 ul 500 ul 1000 ul
DNaseⅠ(50U/ ul) 200 ul 500 ul 1.0ml
DNaseⅠBuffer 200 ul 500 ul 1.0ml -20°C
Equilibration Buffer 1.0ml 2.5ml 5.0ml
TdT Enzyme 80 ul 200 ul 400 ul
Biotin-11-dUTP 20 ul 50 ul 100 ul -20°C，避光
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）
实验概要
Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理
Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂
1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：
Annexin V 核酸染料
Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或
Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No.
34321X)
Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E)
Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No.
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法是利用特定的实验手段和技术来识别细胞凋亡的发生与否，观察细胞凋亡的程度。细胞凋亡检测是生物过程中重要的一块，其能够反映细胞死亡的类型，从而可以帮助研究者确定细胞是否已经进入凋亡状态。
现在，细胞凋亡检测的常用方法有多样，包括水解酶活力分析、流式细胞术、免疫组化、细胞图像分析等。
1. 水解酶活力分析：水解酶活力分析法是目前使用最多的细胞凋亡检测方法，原理是以细胞内的水解酶活性（如肌酸激酶、核糖核酸酶）来反映细胞凋亡程度。细胞凋亡检测方法将细胞悬液添加到活性检测液体，然后经过细胞溶解和脱水稀释后，细胞内的水解酶（如肌酸激酶或核糖核酸酶）就会被释放出来，测定其活力值。通过比较正常细胞和凋亡细胞的活力值，可以判定细胞凋亡的程度。
2. 流式细胞术：流式细胞术是一种常用的检测细胞凋亡的方法，主要以细胞的DNA含量与形态特点作为检测凋亡的标志物。通常，凋亡细胞的DNA含量要明显低于正常细胞，且凋亡细胞的形态特征也会发生明显的变化，比如大小、形状、酸性等。
3. 免疫组化：免疫组化是一种利用免疫细胞学技术检测细胞凋亡的方法，它主要是针对细胞凋亡伴随而出现的特定抗原，如多种酶、APO2.7及特有蛋白等。通过洗涤细胞，并用带有特定抗原的抗体制作出免疫印迹，就可以观察到细胞凋亡的现象。
4. 细胞图像分析：这是一种以细胞形态及细胞图像分析来检测细胞凋亡的方法，主要是利用荧光显微镜或电子显微镜观察细胞，以及对被观察细胞的形态特点进行分析，根据细胞形态变化观察凋亡程度。通过观察正常细胞与凋亡细胞的形态比较，便可以判断细胞是否进入凋亡状态。
上述是现时比较常用的细胞凋亡检测方法，它们都有一定的特点，可以根据不同的实验需求选择合适的检测方法。然而，对于不同的细胞类型，其凋亡方式也可能会有所不同，可能需要使用不同的检测方法来进行识别细胞凋亡的发生与否。因此，根据具体的实验，研究者可以选择合适的检测方法，配合研究凋亡发生机制，为研究凋亡提供科学依据。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代⼈们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡⽅式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增⾼，细胞肿胀，核碎裂，继⽽溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis⼀词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着⽣命⾛到了尽头，细胞到了⼀定时期会像树叶那样⾃然死亡。凋亡是细胞在⼀定⽣理或病理条件下遵守⾃⾝程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表⾯微绒⽑消失，染⾊质凝集并呈新⽉形或块状靠近核膜边缘，继⽽核裂解，由细胞膜包裹着核碎⽚或其他细胞器形成⼩球状凋亡⼩体凸出于细胞表⾯，最后凋亡⼩体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的⽣化变
化特征是核酸内切酶被激活，染⾊体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA⽚段，再进⼀步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸⽚断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素⼲扰等⽅⾯都起着关键性的作⽤。1．细胞凋亡的检测⽅法
凋亡细胞具有⼀些列不同于坏死细胞的形态特征和⽣化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制⼗分复杂，⼀般采⽤多种⽅法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析⽅法有所不同，⽅法选择依赖于具体的研究体系和研究⽬的（表？）。
表凋亡的检测⽅法（引⾃DL 斯佩克特
等，2001）
⽅法细胞
类型
特点说明
形态学/细胞旋转不限
简单、
快速、
低廉、
贮存⽆
限制
略带主观性，
但可靠Hoechst染⾊不限极快，
不能贮
存
略带主观性，
但可靠
吖啶橙/溴化⼄锭不限
极快，
不能贮存
凋亡初期可
⽤，略带主观
性，但可靠FACS/FSC X SSC ⾮贴
(AnnexinV-FITC) PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况
（AnnexinV－FITC）/ PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况：
原理：
细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。荧光素FITC 标记的Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。FITC-Annexin V结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染，而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。联合应用AnnexinV-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，AnnexinV(-)/PI(-)代表健康活细胞，AnnexinV(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，AnnexinV(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。
步骤：
1．如上法构建杀伤体系 靶细胞0.5ml、效细胞0.5ml，分别加入24孔培养板，
置37℃、5％CO2培养箱中分别孵育3h、6h、12h；
2. 把杀伤体系中的细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞）；
3. PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度；
4. 加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心5min，弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于1×105），然后1000g离心5min，收集细胞；
5. 加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞；
6. 加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min；