western blot 参照步骤
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
Western Blotting 流程详细版
Western Blotting 流程详细版1，收细胞。
从细胞间取出要收样的细胞，可以用两种方式进行处理（处理前准备好碎冰，并配好细胞裂解液，在所需量的细胞裂解液中加入leupeptin和PMSF，两者均为100X）：（1）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸去残液（彻底吸干净）。
直接在板中加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well），冰上静置5min。
再吸入预冷的1.5mlEP管中，准备超声(10cm板的细胞裂解液请分装至2到3个EP管中，方便超声)。
（2）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸净。
再在板中加入PBS（6孔板：500ul/well；6cm板：2ml/well；10cm板：5ml/well），用干净的细胞刮将板中的细胞刮下，转移至1.5mlEP管中（推荐每个EP管500ul左右液体，方便超声）。
2000r，5min，4℃。
如果想尽可能多收细胞，可以在刮过的板里再重复加一次PBS（用量见前述），待之前的管离心之后，再加入，重复离心一次。
离心之后，真空泵或移液枪吸去上清（用200ul tip头，尽可能吸干净）。
加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well）。
准备超声。
2，超声破碎细胞。
EP管置于冰上，每管按如下程序超声：超声时间1~2s/次，间隔5~10s 再重复下一次，总共10~20次。
超声后的样品与未超声样品相比更澄清。
超声效率推荐为20%，持续时间不宜过长，否则容易出现泡沫以及焦化现象。
超声1~2s时，可以将EP管从冰上拿出，以便操作，超声后立即放回冰上。
3，超声后离心，最大转速，30min，4℃。
离心后将上清转入新的干净EP管中（沉淀可以加入10ulSDS loading buffer混匀后，煮沸，跑胶，以验证目的蛋白是否残留于沉淀中，或是只存留于沉淀中）。
--Western blot 详细步骤(中文版)
Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。
2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。
2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。
倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。
3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。
4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。
6.接通电源，积层胶电压为60V。
7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。
8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。
9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。
11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。
12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。
13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。
14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
western blot步骤整理
Western Blot（免疫印迹）【配胶】#玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
#10%分离胶在加入1.2.3.5.6后，取200ul于干净EP管中，再向EP管中加3ul TEMED，立即加入电泳槽中，用来封底，防止漏胶。
#按上表配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，胶要沿玻璃一端流下。
待分离胶胶面上升到合适高度（用梳子比量一下，大约离梳子下缘一指位置）。
#然后向分离胶上加一层水压胶，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需要高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
如果有小气泡，加水至水溢出，气泡便可随溢出的水而被带出。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形.）#当水和胶之间有一条折线时，说明胶已凝。
再等3min使胶充分凝固就可倒去分离胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（封胶大约需要30min）#按上表配5%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（梳子光面朝向自己，插梳子时要使梳子保持水平）。
（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
）#由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1—2次就行了，不补胶问题也不大。
）#套上塑料袋，4度过夜。
或室温下1h左右胶便可凝固。
【加样】#隔夜取出或室温1h胶凝固后，将梳子垂直拔出。
#用水冲洗几次浓缩胶。
（注意动作要轻柔）#将胶放入到电泳槽中#测完蛋白含量后，计算含20--50ug蛋白的溶液体积即为上液量。
取出上样样品至200ul的EP管中，加入5*SDS加样缓冲液至终浓度为1* .（上样总体积一般不超过15ul,加样孔的最大限度可加20ul样品）。
上样前要将样品于沸水中煮5min—10min使蛋白变性。
（在水中煮蛋白有2个弊端：（1）EP管容易炸开，样品丢失；（2）容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量。