sds page 配置方法

1mM EDTA, pH8.0。
实验步骤：
1、准备 SDS-PAGE 凝胶 [1]. 按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。 [2]. 装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。 [3]. 确定凝胶浓度体积，按表12-2配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯配制。 [4]. 小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到足够高度。 注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）。 [5]. 轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝 胶聚合的抑制作用。 [6]. 凝胶充分聚合。时间约30~60min, 聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。 [7]. 倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液 体。 [8]. 按表12-3配制浓缩胶，并注入分离胶上端。插入梳子。插入梳子子应小心避免梳子顶 端留有气泡。
[4]. 10 % SDS（十二烷基硫酸钠）(电泳级)：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至 100ml，室
温保存。 [5]. 10% 过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵溶解于 1ml 双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应每周
新鲜配制。 [6]. TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二胺）： 原液使用。应使用电泳级 TEMED。 [7]. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M 甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。
聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr），在交联剂甲叉双 丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物（图 12-1）。
图 12-1 丙烯酰胺的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基， 过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）和 N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine， TEMED）就是这样的催化诱发系统。聚丙烯酰胺的聚合反应是通过加入过硫酸铵启动的，添加 TEMED 加速聚合反应。过硫酸铵提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基。诱发剂 TEMED 能加速过硫酸铵形成自由基，使丙烯酰胺单体转变为自由基态。被激活的单体和未被激活的单 体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互连 成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。溶液的 pH 对聚合作用是重要的，因为过低 pH 没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝 胶时，在加过硫酸胺之前，混合物必须抽去空气。 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于 SDS 和巯基乙醇作用，使得蛋白质分子中二硫键还 原，氨键、疏水键打开，SDS 按 l.4g SDS/1g 蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成 SDS-多肽复合物。因十二烷基磺酸根带负电，使各种 SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷。
配制方法： 在 900 ml 去离子水中溶解 15.1g Tris 碱和 94 g 甘氨酸（电泳级）（pH8.0）， 然后加入 50 ml 10% SDS（电泳级），用去离子水补至 1000 ml。 [8]. Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM tris，250mM 甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。 [9]. 1×SDS 样品缓冲液：50mM Tris-Cl (pH6.8)，100mM DTT, 2％ (m/v) SDS，0.1％(m/v) 溴酚蓝，10%（v/v）甘油。不含 DTT 的 1×SDS 样品缓冲液可在室温保存。DTT 配 成 1M 的贮存液，临用前加入。 [10]. 2×SDS 上样缓冲液：100mM Tris-HCl (pH6.8)，200mM DTT，4% (m/v) SDS，0.2% 溴 酚蓝，20%甘油。 [11]. 5×SDS 样品缓冲液：250mM Tris-HCl (pH6.8)，500mM DTT，10％ (m/v) SDS，0.5 ％(m/v) 溴酚蓝，50%（v/v）甘油。不含 DTT 的 5×SDS 样品缓冲液可在室温保存。 DTT 配成 1M 的贮存液，临用前加入。 [12]. 蛋白质分子量标准物（marker） [13]. 考马斯亮蓝凝胶染色液：将 0.25 g 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250 溶解 在 90ml 甲醇：水（1：1，v/v）和 10ml 冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。 [14]. 20% 硝酸银（silver nitrate，AgNO3）溶液：用去离子水配制，棕色瓶室温避光保存。 也可以使用前直接配置：0.625g 硝酸银溶解于 250ml 去离子水中。
凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同 SDS-多肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效应
（图 12-3）。微孔的大小由于 Bis 和 Acr 的比例和凝胶的浓度决定。
表 12-1 列出了凝胶浓度与有效分离范围。
图 12-4 显示了不同浓度聚丙烯酰胺凝胶对同一样品中各蛋白组分的分离效果。
表 12-1 蛋白质在聚丙烯酰胺的有效分离范围
实验 12 蛋白表达的 SDS-PAGE 检测 实验目的：
使学生掌握蛋白质电泳检测常用技术：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以及聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue，R-250）染色技术。同时此实验还要学生掌握如何检测分析蛋白原核表达的状态， 即判断蛋白原核表达部位：培养液（medium部分 （periplasmic fraction）、包涵体部分（insoluble fraction）。 实验原理：
烯酰胺形成的交链增加了凝胶的硬度和韧性，形成了 SDS-多肽混合物通过的孔。这些孔的大小 随着双丙烯酰胺：丙烯酸胺比例的增加而变小，当这个比例达到约 1∶20 时这些孔的孔径达到 最小。大多数 SDS-聚丙烯酰胺凝胶是由一摩尔的双丙烯酰胺与 29 摩尔的丙烯酰胺所组成，这 是一个能够按大小分辨多肽而误差小于 3％的经验比例。这样，凝胶的过滤性质是由孔的大小 而决定的，而这些孔的大小是由加人到凝胶中的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的绝对浓度所决定的。
[15]. 1M IPTG（异丙基硫代-β-D 半乳糖苷）：在 8ml 蒸馏水中溶解 2.383g IPTG 后，用蒸馏 水定容至 10ml，用 0.22μm 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存-20℃。
[16]. 10% 三氯乙酸（TCA）：50g TCA 中加入 22.7ml 水，形成的溶液含有 10%（w/v）TCA。 [17]. 细胞裂解液：1mg/ml 溶菌酶（lysozyme）, 20% (m/v) 蔗糖（sucrose）, 30 mM Tris-HCl,
它的量大大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子问原有
的电荷差别。同时，在水溶液中，SDS-多肽复合物具有近似的形状(长椭圆棒状)，并且不同 SDS多肽复合物的短轴长度趋于一致，而长轴与分子量成正比（图 12-2）。这样。SDS-多肽复合物， 在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分 子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系。
表 12-2 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 分离胶配方
凝胶浓度 试剂
不同体积凝胶电泳分离胶所需体积 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 35ml 40ml
H2O
2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5
考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合物，复合物的形 成可能是范德华力及 NH3+基团的静电作用共同作用的结果。考马斯亮蓝用于聚丙烯酰胺凝胶 电泳后的蛋白质染色，蛋白质对染料的吸附量与蛋白质的量大致成正比，符合比尔-朗勃定律。
目前已经建立了很多用银盐对 SDS-PAGE 分离的多肽染色的方法，基本原理都是利用银离 子结合在氨基酸侧链上之后还原程度的差异。常用的银盐有银铵溶液和硝酸银，检测灵敏度都 高出考马斯亮蓝 R-250 染色 100~1000 倍，且能在一条带上检测出 0.1~1.0ng 的多肽。因硝酸银 溶液更容易配制，且不会产生像银铵盐染色中产生的易爆副产物，实验中应用得更多。
图 12-6 垂直电泳装置及不连续胶的位置、蛋白上样及电泳方向
SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质可通过考马斯亮蓝染色（Coomassie staining）或银染 色（silver staining）在胶上直接显示观察。一块胶可先做考马斯亮蓝染色，之后脱色再进行银染 色。两种染色程序都和蛋白质的质谱分析兼容。或者，蛋白质可以通过电转印（electroblotting） 转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，进行 Western blot 分析（实验 13）。
凝胶浓度（％）
分离范围 （kDa）
15
10~43
12
12~60
10
20~80
7.5
36~94
5.0 Bis: Acr 的分子比为 1∶29
57~212
图 12-4 不同浓度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同一蛋白样品的结果 (From: )
图 12-5 浓缩胶和分离胶、上样及样品在浓缩胶中的聚集 多数情况下，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的缓冲液系统。在这一系统中，一 般凝胶分为低浓度的浓缩胶（也称“堆积胶或成层胶”）和较高浓度的分离胶 （图 12-5、12-6）。 配制凝胶的缓冲液也有不同的 pH 和离子强度。在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，在移动慢的拖 尾离子（甘氨酸）和移动快的前导离子（氯离子）之间形成了一个界面，这是一个通常根据折 射系数不同而形成的可见的窄窄的条带。移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡 的区域，推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚。当蛋白质样品在浓缩胶中电泳时，蛋白 质富集在前导离子和拖尾离子之间的一个窄窄的条带中，SDS-多肽复合物沿移动的界面迁移， 最终在分离胶表面聚集成一条很细的区带（积层），极大地浓缩了样品的体积，这就是所谓的浓 缩效应（图 12-5）。分离胶 pH 较高，有利于甘氨酸的解离，形成甘氨酸离子穿过堆积的多肽并 紧随氯离子之后，在分离胶中泳动。SDS-多肽复合物从移动界面中解脱开来，在电位和 pH 均 匀的分离胶区段泳动，通过分离胶的分子筛作用按分子大小不同得到分离（图 12-6、12-7、12-8）。