酵母双杂交
酵母双杂交
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酵母双杂交
酵母双杂交是一种实验技术，用于研究酵母菌的互作关系和蛋白质相互作用。
该技术基于酵母菌的能力，通过融合两个不同的酵母菌菌株，实现蛋白质的相互作用检测。
酵母双杂交的原理是利用一对可活化转录因子的融合蛋白，一个与实验蛋白A结合，另一个与实验蛋白B结合。
当A和B结合时，转录因子活化，启动报告基因的表达。
这种实验设置允许检测蛋白质A和B之间的相互作用。
通过酵母双杂交实验，可以筛查大量的蛋白质相互作用，从而揭示酵母菌细胞中复杂的信号传导网络。
这种技术被广泛应用于研究酵母菌的生物学过程、蛋白质功能以及疾病机制等方面。
它为揭示蛋白质相互作用网络提供了一种系统的方法。
1。
酵母双杂交
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能，互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能，
•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交的原理及流程
酵母双杂交的原理及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母双杂交
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain 的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核诓拍芮 ǜ婊 虻淖 肌＠ 鏕AL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad 没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂杂交回复验证实验
酵母双杂杂交回复验证实验一、引言酵母双杂杂交回复验证实验是一项常用于研究酵母菌遗传性状的实验方法。
通过将两个不同株系的酵母菌互相杂交，观察其后代的表型，可以确定不同基因型对于特定性状的影响，以及基因之间的相互作用关系。
这项实验提供了一种有效的手段来研究酵母菌的遗传特性，并为从酵母菌到其他生物的研究提供了重要参考。
二、实验设计1. 实验目的确认酵母菌的遗传性状以及基因型之间的相互作用关系。
2. 实验步骤1.选取两个不同基因型的酵母菌株进行杂交。
2.将两个酵母菌株分别培养在适宜的培养基上，以获得足够数量的酵母菌细胞。
3.将两个酵母菌株的细胞混合在一起，使其进行杂交。
4.将混合后的酵母菌细胞培养在选择性培养基上，以筛选出杂交后的酵母菌子代。
5.观察酵母菌子代的表型特征，并将其形态记录下来。
3. 实验材料•两个不同基因型的酵母菌株•培养基及培养仪器•选择性培养基4. 实验结果通过观察酵母菌子代的表型特征，可以得到各个基因型对于特定性状的影响情况。
如果两个酵母菌株的基因型在某一性状上有不同表现，那么杂交后的子代在该性状上可能表现出两种不同的表型。
这种表型的分离现象可以帮助确定酵母菌的遗传性状。
5. 实验分析通过对大量的酵母菌子代进行观察和统计，可以得到不同基因型对于特定性状的影响程度，以及基因之间的相互作用关系。
这些数据可以用来构建酵母菌的遗传模型，推测特定基因在遗传性状中的作用机制。
三、实验应用酵母双杂杂交回复验证实验在酵母研究领域具有广泛的应用价值。
以下是一些应用示例：1. 基因功能研究通过观察不同基因型的酵母菌子代的表型，可以推测特定基因在酵母菌生命周期、代谢途径等方面的作用。
这对于全面理解基因功能具有重要意义。
2. 病原机制研究酵母双杂杂交回复验证实验可以帮助研究人员解析酵母菌导致疾病的机制。
通过分析酵母菌的基因型与特定疾病的发生关系，可以发现关键基因及其表达调控途径，为疾病治疗和预防提供新思路。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交
酵母双杂交随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成, 基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。
功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述, 尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。
系统综合分析蛋白- 蛋白相互作用将为了解蛋白质的功能提供重要的信息。
酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。
它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术, 可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。
酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。
随着人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序的完成, 酵母双杂交及其衍生的相关技术将在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导和肿瘤基因表达等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
一、酵母双杂交原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
二、酵母双杂交的系统酵母双杂交常用的有两种系统，第一种为LexA系统：DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 第二种为Gal4系统：BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。
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X DBD-X 融合蛋白 DBD Y
Y
AD-Y AD 融合蛋白
AD
报告基因产物 激活转录 构建 表达
UAS 上游激活序列
报告基因 即：DBD-X为诱饵蛋白，AD-Y为猎物蛋白
一般步骤
1.改造酵母
使用特定的营养缺陷型菌株 例：Trp与Leu缺陷型，即酵母菌自身不能合成Trp和Leu，需 要从培养基中吸收Trp和Leu。
酵母双杂交系统的优点
•根据目标蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白， 不需分离靶蛋白 •蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相 互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合 也可被检测出来，真实反应体内蛋白质间相互作用情况
•可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断 目的蛋白的结的足够丰富的多样性 提供尽可能多地与AD连接位点 插入片段不能过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性增多 选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的是综 合提高双杂交技术的一个重要方面。
改进
•4.利用酵母交配（yeast mating）可以很方便地将两种不 同的质粒转入同一酵母菌株。据此已发展出一套快速鉴 定假阳性的方法。 •5.体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验 证。
常见问题
•2.如果诱饵蛋白DBD-X能直接激活报告基因的表达，该如 何处理？ •该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过 基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活， 但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
常见问题
•3.转化效率太低怎么办？ •可以采用以下方法解决： 1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯 化。 2) DNA-BD很可能是有毒的。 3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4) 共转化或者单独转化
酵母双杂交
学 生 ： Q XCR 专 业 ： @ @@@ 学 号 ： * ************
酵母的特性
•酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） •真核生物的大肠杆菌 •基因组小
•有典型的真核生物的转录后修饰过程
•一个酵母可同时兼容几个不同质粒（带有2μm复制子）
酵母双杂交系统 Yeast two-hybrid system
•6.除了在酵母中应用外，双杂交体系也已扩展到哺乳动 物细胞。
改进
•7. 构建Sos 恢复系统(Sos recruitment system,SRS). •人的鸟苷酸交换因子（GEF）-Sos 蛋白是一种胞质蛋白， 而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25 蛋白定位在内膜上，可 将相关受体信号传导给Ras 蛋白。 •酵母细胞的一种温度敏感菌株-ras途径突变体由于缺乏 鸟苷酸交换因子cdc25，致使该酵母突变体在36 ℃不能 存活，如果引入正常的GEF(Sos 蛋白)，并且使得GEF 能 与Ras 蛋白足够接近，则可以弥补这一缺陷. •将GEF蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与Ras相连，使Y 定位于膜上. 这样，若X 与Y 结合，X 连同的蛋白(GEF)就 会定位于膜上，从而得以靠近膜上的Ras 蛋白，激活ras 途径，完成Sos 过程，在36℃生长。
推荐了解
•酵母单杂交体系 •反向酵母双杂交系统 •酵母三杂交系统
谢谢！
பைடு நூலகம்
常见问题
•4.杂交效率不高，该如何处理？ •在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱 饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆 进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进 行计数。密度应该在1 x 109/ml。 一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。使用表达水 平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。 但同时必须作杂交对照实验。
•虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中 部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长 发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的。 因此，对于筛选对象和范围，应有一个合适的选择。
改进
•1.发展酵母菌株的多重筛选机制 •2.表达载体的构建
◦ 可被诱导的启动子 ◦ DBD或AD与作用蛋白质的连接方式
•敏感性高
常见问题
•1.如果DBD-X对酵母细胞是有毒的，该怎么办？ •某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固 体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp， 接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃ 下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5×YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样 就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。
•1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质 相互作用的方法。 •以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。
转录激活因子GAL4的特点
•N端含有核定位序列（NLS）和与酵母GAL1基因启动子上 游激活序列(UAS)相结合的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD) •C端含转录激活结构域 (activating domain, AD) •功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在 一起才具有完整的转录因子活性
P
AD
AD
LEU2
DBD P
Y
T
3.转化筛选
Promoter 启动子
Terminator 终止子
X
X
Y
DBD
DBD
AD
酵缺 母陷 菌型 第一次转化 -Trp培养基 筛选 第二次转化 -Trp/-Leu培养基 筛选
4.检测——蓝白斑
激活转录 UAS 上游激活序列 报告基因 lacZ 表达 X-gal 白色
酵母双杂交系统的局限性
•表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符， 造成结果的不准确 •假阳性，本身就具有转录激活活性的目标蛋白不适合于 该系统 •并非对所有蛋白质适用，不能定位于核内的兴趣蛋白不 适合于该系统 •需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统
酵母双杂交系统的局限性
•大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株 生长及报告基因的表型 •在某些酵母菌株中。为了抑制背景表达而在培养基中添 加的3-AT也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的 相互作用可能会因此而被掩盖
GAL4激活转录过程
GAL4转录激活因子基因 转录翻译GAL4
DNA binding domain DBD AD Activating domain 转录激活结构域 结合结构域
Gene
DBD AD
激活转录
UAS 上游激活序列
AD
激活转录
DBD
设计思路
蛋白 构建 DBD X AD Y 是否相互作用？
UAS 上游激活序列
报告基因 lacZ β-半乳糖苷酶基因
2.构建载体
用X的cDNA构建DBD-X穿梭表达载体
酵母细胞 复制起始点
用Y的cDNA构建AD-Y穿梭表达载体
酵母细胞 复制起始点
Ampr
2μ ori
Ampr
2μ ori
X
Y
Terminator 终止子
T X
DBD
TRP1
Promoter 启动子
lacZ β-半乳糖苷酶 蓝色
-Trp/-Leu培养基
-Trp/-Leu/+X-gal培养基
5.序列分析 •从酵母中分离质粒然后转化E. coli •从大肠杆菌中提取质粒并测序 •在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
酵母双杂交系统的应用
•分析、验证已知蛋白之间的相互作用 •确定蛋白质 质 •绘制蛋白质相互作用系统图谱 •在药物设计中的应用