乳酸脱氢酶制备
乳酸脱氢酶乳酸底物法_概述及解释说明
乳酸脱氢酶乳酸底物法概述及解释说明1. 引言1.1 概述乳酸脱氢酶乳酸底物法是一种常用的生化实验方法，通过利用乳酸脱氢酶催化反应，将乳酸转化为丙酮酸，并同时生成NADH。
该实验方法可以用来测定样品中乳酸的含量，广泛应用于医学、生物学和食品工业等领域。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分进行介绍。
首先，在引言部分将对乳酸脱氢酶乳酸底物法进行概述。
接下来，第二部分将详细介绍乳酸脱氢酶的基本原理以及乳酸底物法的工作原理。
第三部分将介绍该实验方法的具体步骤和执行要点。
在第四部分，我们将展示和解读实验结果，并对数据进行分析与讨论。
最后，在第五部分中给出本次实验的主要结论，并对未来进一步研究和应用进行展望。
1.3 目的本文旨在向读者提供关于乳酸脱氢酶乳酸底物法的全面了解。
通过介绍该实验方法的原理、步骤和结果分析，读者将能够掌握该方法的基本操作技巧，并了解其在不同领域中的应用场景和价值。
对于有意开展相关研究或者需要使用该方法的科研人员和实验室来说，本文将提供一份有用的参考资料。
2. 乳酸脱氢酶乳酸底物法概述：2.1 乳酸脱氢酶简介：乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，简称LDH）是一种重要的代谢酶，存在于多种生物体内。
它主要参与细胞内的糖酵解过程，在无氧条件下将产生的乳酸转化为丙酮酸，从而供能给细胞。
LDH在各种组织中广泛分布，包括肝脏、肌肉、心脏等，因此具有广泛的应用价值。
2.2 乳酸底物法原理：乳酸底物法利用了LDH对乳酸的催化作用。
该方法通过将待测样品中的乳酸与辅助底物（如双硫苏糖）反应，同时加入LDH作为催化剂，在一定条件下观察和测定产生的反应物（如NADH）含量变化。
由于LDH能够特异性地催化乳酸生成丙酮酸的反应，所以可以通过测量NADH生成速率来间接确定待测样品中乳酸浓度的高低。
2.3 应用场景和价值：乳酸脱氢酶乳酸底物法具有一定的应用价值。
首先，该方法操作简便、快速，不需要复杂的设备和步骤，适用于实验室中对乳酸浓度进行初步检测与筛选。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明乳酸脱氢酶（LDH）法操作说明操作简介：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种常用的生物化学分析方法。
本文将详细介绍使用乳酸脱氢酶法进行实验操作的步骤。
材料准备：1. 乳酸脱氢酶试剂盒2. 样品溶液3. 乳酸标准品4. 实验用试管和显微管操作步骤：1. 样品制备- 将待测样品装入实验用试管中。
每个样品应分别装入不同的试管，以避免交叉污染。
- 若样品过浓稀，需要进行适当的稀释，确保样品浓度在测试范围内。
2. 标准曲线制备- 准备不同浓度的乳酸标准品溶液，浓度范围可根据实验要求而定。
- 将不同浓度的标准品溶液分别装入实验用试管中。
3. 试剂添加- 分别向样品管和标准品管中加入相同体积的乳酸脱氢酶试剂，充分混匀。
4. 反应温育- 将所有试管置于恒温水浴中，温度设定为适合乳酸脱氢酶反应的温度（一般为37°C）。
- 在设定的反应温度下，将试管保持在水浴中反应一段时间（时间根据实验要求而定）。
5. 反应终止- 在反应时间结束后，以适当的方法终止反应。
常见的终止方式是添加酸性试剂或采用其他合适的方法。
6. 测定乳酸脱氢酶活性- 使用光度计、分光光度计或其他合适的仪器，测定样品和标准品反应后产生的光吸收值。
吸收值与乳酸脱氢酶活性成正比。
- 通过标准曲线，将样品的吸收值转化为对应的乳酸脱氢酶活性。
注意事项：1. 本实验操作需要严格按照实验室安全操作规范进行，避免任何可能导致个人受伤或污染的行为。
2. 实验过程中的试剂、标样和废液等应按照实验室规定的方法处理，不得随意丢弃。
3. 在操作过程中，保持实验器材和试剂的洁净，尽量避免外界因素对实验结果的影响。
4. 操作时需注意避免交叉污染，尤其是样品的装管和试剂的配比过程。
5. 样品和标准品的选择要合适，浓度范围应覆盖实验要求。
6. 温育过程中，确保试管能均匀受热，并避免发生温度不稳定的情况。
总结：乳酸脱氢酶（LDH）法是一种可靠的生物化学分析方法，适用于乳酸脱氢酶活性的测定。
乳酸脱氢酶的分离纯化及其催化合成苯乳酸的研究进展
Recent advances in separation of lactate dehydrogenase and its applications in catalytic synthesis of phenyllactic acid
FU Minxia, ZHU Lingyu, YUN Junxian
收稿日期：2018-01-22；修改日期：2018-03-01。 基金项目：国家自然科学基金（21576240）及浙江省自然科学基金 （LZ14B060001）项目。
第一作者：富敏霞（1992—），女，硕士研究生，研究方向为传质与分离。 E-mail：fumx123@。通讯作者：祝铃钰，教授，博士生导师， 研究方向为分离工程及化工过程优化。E-mail：zhuly@。
1 乳酸脱氢酶的主要来源
乳酸脱氢酶广泛存在于微生物和动物各种组织 之中，不同来源的乳酸脱氢酶性质差异较大[27-30]。 按照催化生成苯乳酸构型不同，可将乳酸脱氢酶分 为 D- 乳 酸 脱 氢 酶 （ D-LDH ） 和 L- 乳 酸 脱 氢 酶 （L-LDH），分别催化苯丙酮酸生成有光学纯度的 D-苯乳酸和 L-苯乳酸。 1.1 微生物来源
2 乳酸脱氢酶的分离纯化方法
除了核酶以外，大多数酶本质上是蛋白质，其 分离纯化的重点不仅需要考虑目标蛋白质与其他杂 蛋白的分离，同时更加关注酶的稳定性。目前，从 微生物中分离纯化乳酸脱氢酶的步骤主要包括细胞
乳酸脱氢酶制备
乳酸脱氢酶制备原理:乳酸脱氢酶( LDH)( EC1.1.1.27 )存在于具糖无氧代谢途径的细胞中，为水溶性酶，催化如下反应：L (+)—乳酸+NAD f丙酮酸+ NADH +H乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。
制备的方法为捣碎心肌组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最后结晶出乳酸脱氢酶。
乳酸脱氢酶活力检测原理是在pHIO.O的条件下，LDH催化NAD 还原生成NADH NADH在340nm有最大吸收，摩尔消光系数为 6.2 X 103, NADH勺分子量为663.44。
LDH活力单位定义为：25 C、每分钟催化生成1微摩尔NADH的酶量为1个活力单位。
用紫外分光光度计测定酶反应进程的OD4。
的增量，可求出制备样品中的LDH活力。
试剂：(1) CaCl 2 ?6H2O(2) Na 3PO4(3) 冰乙酸(4) 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液( pH7.2)(5) 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液( pH7.2)(6) 0.3 饱和度的硫酸铵溶液( 19.5g/100ml )(7) 丙酮（8）硫酸铵粉末（9）0.5mol/L DL- 乳酸钠。
（10）2mmol/L NAD容液：称取133mgNAD,溶于5ml蒸馏水中，加入约0.15ml 1mol/L NaOH 调pH为 6.0，定容10ml，冰箱贮存。
（11）0.1mol/L pH10.0 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液A液0.2mol/L甘氨酸溶液：称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。
B液0.2mol/L NaOH溶液：称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。
取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容200ml。
操作：一、磷酸钙胶制备（1）称取19.8g CaCl2?6HzQ 溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释成1600ml。
（2）称取22.8g Na3PQ?12HQ溶于150ml蒸馏水中。
（3）将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙胶沉淀。
乳酸脱氢酶冻干配方
乳酸脱氢酶冻干配方英文回答：Lactate dehydrogenase (LDH) is an enzyme that plays a crucial role in the conversion of lactate to pyruvate during anaerobic glycolysis. LDH is widely used in various fields, including clinical diagnostics, food industry, and research. To ensure the stability and long-term storage of LDH, freeze-drying or lyophilization is commonly employed. In this response, we will discuss the formulation of a freeze-dried LDH preparation.The formulation of a freeze-dried LDH preparation involves several key components and steps. These include the selection of excipients, the preparation of the LDH solution, the freezing process, and the lyophilization process.1. Excipients: Excipients are substances added to the LDH solution to enhance stability, protect the enzyme fromdenaturation, and improve the reconstitution properties of the freeze-dried product. Commonly used excipients for LDH freeze-drying include sugars (such as sucrose or trehalose), bulking agents (such as mannitol), and cryoprotectants (such as polyethylene glycol).2. LDH solution preparation: The LDH solution is prepared by dissolving LDH enzyme in a suitable buffer solution. The buffer helps maintain the pH and stability of the enzyme during the freeze-drying process. The concentration of LDH in the solution may vary depending on the desired activity of the final product.3. Freezing process: After the LDH solution is prepared, it is subjected to a controlled freezing process. Slow freezing is typically employed to minimize the formation of ice crystals, which can damage the enzyme structure. The freezing process can be achieved using specialized equipment, such as a freeze-drying machine or a controlled-rate freezer.4. Lyophilization process: Once the LDH solution isfrozen, it undergoes the lyophilization process. During lyophilization, the frozen LDH solution is subjected to reduced pressure, and the ice is sublimed directly from the solid state to the vapor state. This process removes the water content from the LDH solution, resulting in a dry and stable product.The freeze-dried LDH preparation can be reconstitutedby adding a suitable amount of water or buffer solution.The reconstituted LDH retains its enzymatic activity andcan be used for various applications, such as enzyme assays or diagnostic tests.中文回答：乳酸脱氢酶（LDH）是一种在无氧糖酵解过程中将乳酸转化为丙酮酸的关键酶。
用电子束辐射法制备固定化乳酸脱氢酶
0
磷 酸 缓冲 液 中 的 乳 酸 脱 氢酶 溶 液 ( 凝胶 的 制 备
毫克 /毫
升)
.
以 下 处 理 过 程及 方 法 同 上 述
(三 )
1
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酶 的 活 力测定
活 力测定 的原 理
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一
10
北 京师 范 大学 学 报
1 9 8 2年
第三期
用 电子 束 辐 射 法 制 备 固 定 化 乳 酸 脱 氢酶
田美荣
刘东 元
(化 学 系 放 辐 化研 究 室 )
前
固定 化酶 的制备
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言
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近 年 来已 有 许 多 进 展
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固 定 化 技 术 之 一 的 凝 胶格 子 包 埋 法
,
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聚合 反 应 催 化 剂
近 十年 来
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在 光 照 下进 行 聚 合
,
将酶 包埋 在 凝 胶 格 子里
“
开 始将 辐 射诱 导 聚 合反 应 应 用 于 水 溶 液 单 体或 聚 合 物 的 交联 聚 合 比
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图 制备 固 定化 酶 域
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这 一 方法 步 骤简 便
乳酸
0
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实验三十一亲和层析纯化乳酸脱氢酶
实验三十一亲和层析纯化乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)是机体代谢中一个很重要的酶，它催化下述反应：LDH丙酮酸+NADH+H+=乳酸+NAD+现已明了，大多数动物体内的LDH含有5种同工酶。
它们是由两种亚基(H亚基与M 亚基)按不同组合形成的四聚体，其中LDH–1和LDH-5分别为四个H亚基和四个M亚基组成的纯合体。
后来在很多动物睾丸和精子中，又发现了另一种LDH同工酶命名为LDH-X，由四个x亚基组成。
已经证明，形成不同LDH同工酶的上述三种亚基是由三个不同的基因所编码。
LDH的各种同工酶的蛋白质组成与结构，生物体内的组织分布、酶学性质与生理功能均各有差异。
因此，纯化LDH的各同工酶并对其进行比较酶学的研究，对于进一步认识蛋白质结构与功能的关系，机体内代谢的调控以及基因的进化等均有重要意义。
在这方面，国外学者已做了很多工作，已取得不少有意义的结果。
早期的LDH纯化比较繁琐，周期长，收率低。
20世纪70年代以来，由于有Axen等人的开创性工作，亲和层析技术得到迅速发展，由于其专一性强，操作简捷，回收率高等特点，已成为分离纯化生物大分子的强有力的手段。
由于使用了能与酶专一结合的配基，尽管各种同工酶在电荷效应或肘，上存有差异，均能得到较高的回收率。
这对于LDH同工酶的研究是很有意义的，尤其对纯化体内含量甚微的某些LDH同工酶如LDH-X，亲和层析更是最为理想的手段。
实验原理亲和层析(affinity chromatography)是在一种对目的分子具有专一吸附能力的吸附剂上进行的层析。
这种专一吸附能力是由于共价偶联在惰性载体上的物质[通常称为配基(1igand)]与需要纯化的物质之间存在一种专一的可逆的亲和力。
相互具有这种亲和力的生物分子有：抗体与抗原，酶与其底物或抑制剂，激素与其受体等。
将具有这种亲和关系的两种分子(A、B)中的一种(比方A)以共价偶联到载体上，则可成为纯化另一种分子B的亲和吸附剂。
乳酸脱氢酶实验原理
乳酸脱氢酶实验原理
乳酸脱氢酶（LDH）实验原理是基于LDH催化乳酸与辅酶NAD+之间的反应。
LDH催化乳酸脱氢成为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。
该反应可以用下式表示：
乳酸 + NAD+ ⇌丙酮酸 + NADH + H+
在实验中，乳酸存在时，LDH会将乳酸氧化为丙酮酸，同时产生NADH。
NADH的生成量可通过光密度变化来测定。
NADH的光密度在340 nm波长下较高，因此可以使用分光光度计对其吸光度进行测量。
根据比色法原理，可以通过测量样品中NADH的吸光度变化来间接测定乳酸的含量。
根据比色法原理，NADH的吸光度与NADH的浓度成正比。
因此，通过测量反应体系中NADH 产生的速率和NADH的吸光度，可以推算出乳酸的浓度。
一般情况下，通过比较样品在LDH反应之前和之后的NADH 浓度变化来测定乳酸的含量。
这可以通过测量吸光度来实现。
吸光度值可以转换为相应的乳酸浓度，从而确定乳酸脱氢酶的活性或乳酸的浓度。
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乳酸脱氢酶制备
原理:
乳酸脱氢酶（LDH）（EC1.1.1.27）存在于具糖无氧代谢途径的细胞中，为水溶性酶，催化如下反应：
L（+）—乳酸+NAD+ →丙酮酸 + NADH +H+
乳酸脱氢酶最早从牛心中分离并获结晶。
制备的方法为捣碎心肌组织用水抽提，磷酸钙胶吸附，硫酸铵分级盐析及有机溶剂沉淀，最后结晶出乳酸脱氢酶。
乳酸脱氢酶活力检测原理是在pH10.0的条件下，LDH催化NAD±还原生成NADH。
NADH在340nm有最大吸收，摩尔消光系数为6.2×103，NADH的分子量为663.44。
LDH活力单位定义为：25℃、每分钟催化生成1微摩尔NADH的酶量为1个活力单位。
用紫外分光光度计测定酶反应进程的OD340的增量，可求出制备样品中的LDH活力。
试剂：
(1)CaCl2•6H2O
(2)Na3PO4
(3)冰乙酸
(4)0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）
(5)0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）
(6)0.3饱和度的硫酸铵溶液（19.5g/100ml）
(7)丙酮
(8)硫酸铵粉末
(9)0.5mol/L DL-乳酸钠。
(10)2mmol/L NAD+溶液：称取133mg NAD+，溶于5ml蒸馏水中，加入约0.15ml 1mol/L NaOH 调pH为6.0，定容10ml，冰箱贮存。
(11) 0.1mol/L pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
A液0.2mol/L甘氨酸溶液：称取15.01g甘氨酸用蒸馏水溶解，定容1L。
B液0.2mol/L NaOH溶液：称取8gNaOH用蒸馏水溶解，定容1L。
取100mlA液与64.0mlB液混合，蒸馏水定容200ml。
操作：
一、磷酸钙胶制备
（1）称取19.8g CaCl2•6H2O，溶于150ml蒸馏水中，用自来水稀释成1600ml。
（2）称取22.8g Na3PO4•12H2O溶于150ml蒸馏水中。
（3）将两溶液混合，用冰乙酸调pH至7.4，室温下放置，使磷酸钙胶沉淀。
（4）吸去上清液，4000r/min离心3min，收集胶体备用。
二、 LDH制备
1、LDH水提取
（1）取100g新鲜或短期冰冻保存的牛心，去除脂肪、血管，称重，切成小块，低温下绞碎。
（2）加入400ml冰冷的蒸馏水，冰浴中搅拌，提取20min。
（3）4000r/min离心3min。
吸出上清液，测量体积并记录。
（4）取样测定LDH活力。
2、磷酸钙胶吸附及洗脱
（5）上清液中加入磷酸钙胶80g左右，置冰浴中搅拌15min。
（6）将胶悬浮液转入离心管中，3000r/min离心3min，弃去上清液，保留磷酸钙胶。
（7）向磷酸钙胶沉淀中加入约0.8倍体积的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，于冰浴中充分搅拌10分钟。
（8）3000r/min离心3min，保留上清液。
测量并记录体积，取样测定LDH活力。
3、盐析
（9）将上清液置冰浴中冷却，搅拌下缓慢加入固体硫酸铵粉末，至
0.6饱和度（按39g/100ml比例加入），冰浴中放置10min。
（10）4000r/min离心5min，弃去上清液
（11）向沉淀中加入20ml0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，使沉淀溶解，测量并记录体积，取样测定LDH活力。
4丙酮沉淀
（12）将溶液置冰浴中，缓慢加入0.6倍体积（要准确）-20℃预冷的丙酮，边加边轻轻搅匀，放置10min。
（13）于4℃4000r/min离心5min，弃去上清液。
（14）沉淀溶于适量蒸馏水，记录体积，测定LDH活力。
三、LDH活力测定
操作：
（1）按下表在两只石英比色杯中分别加入以下试剂：
（2）从样品杯中加入LDH制备液混匀的瞬时开始记时，测定酶反应30秒时的A值。
结果：
将各步骤测定的数据及计算结果填入下表并对制备工艺进行评价。
总活力（μmol/min）=A/6.2×103×3×10-3×60/30×106×V/0.01。