生物竞赛南京大学夏令营分子生物学(2)
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从基因到蛋白质
基因表达
转录 翻译
逆转录
复制 复制
中心法则
DNA的复制
DNA可能的复制方式
DNA半保留复制的实验证明
Matthew Meselson and Franklin Stahl (1958) 大肠杆菌（E. coli）DNA标记实验
Bacterial culture
培养几代
15NH Cl 4
编码链
模板链
转录
翻译
转录 transcription
• 在DNA指导下（以DNA为模板）合成RNA的 过程称为转录。 • RNA聚合酶
RNA聚合酶
NTPs RNA + PPi
模板：DNA；
引物：不需要；
底物：NTP； 合成方向：5’3’； 辅助因子：Mg2+
E.coli RNA 聚合酶
其它密码子
• •
ACACACACACAC….. UGUGUGUGUGUGU…… ACA CAC ACA CAC UGU GUG UGU GUG
更复杂的密码子
•
核糖体结合实验
Phe
核糖体
AAA UUU
Triplet RNA
设立20个不同的反应管，每一个含有一种放射性标记的氨基酸
19AAs + [14C]-Pro and soluble aaRSs
• 起始因子不同；
扫描机制
p.245
还需要：
Kozak’s rules: 一致序列
CCRCCAUGG
-3 +4
肽链延伸
翻译的极性（肽链延伸的方向） 1) 从N端 → C端 2) mRNA阅读方向： 5’ → 3’
氨酰tRNA进位
形成肽键
肽酰转移酶
23s rRNA
转位
终止与释放
终止密码子: amber codon (琥珀型)--- UAG ochre codon (赭石型)--- UAA opal codon (乳石型)--- UGA
•
tRNA反密码环上的三个相邻的核苷酸构成反密码子。
密码子的破译
体外翻译系统
无细胞抽提液 •核糖体 •tRNAs •氨基酸 •酶 •ATP, GTP
+ mRNA =
实验过程: • 设立 20 个反应管 • 每个反应管中加入一种放射性标记的氨基酸 • 加入 poly-U RNA • 酸沉淀回收合成的蛋白质 • 观察哪一个反应管中产生带有放射性标记的酸沉淀？
实验结果预测
实验结果及分析
(CsCl 梯度离心) N15
DNA
N14
半保留复制
M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
结果示意图
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分
别以每条单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基
可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代 DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。
实验结果：
• •
poly-U产生多聚苯丙氨酸（polyphenylalanine）
UUU=Phe Poly-A 产生 polylysine (AAA = Lys) Poly-C 产生 polyproline (CCC = Pro)
用其它mRNA进行同样的实验：
• •
•
Poly-G 产生 polyglycine (GGG = Gly)
B. 均在细胞分裂前期按照碱基互补配对原则复制
C. 均在细胞核内转录和翻译
D. 转录的信使RNA上相同的密码子翻译成相同的氨基 酸 D
2007 南京模拟题
转录和翻译是真核细胞中基因表达的两个重要步骤， 判断下列有关叙述（）： ① 两者需要的原料不同 ② 两者所需酶的种类相同
③ 两者在同一场所中进行
真核生物的启动子
• 三种RNA pol；
• 不同的RNA pol识别不同的启动子； • 需要转录因子(TF)；
翻译
以mRNA为模板，合成蛋白质的过程
称为翻译 (translation)。
• 蛋白质合成的场所：核糖体 • 蛋白质合成的原料：氨基酸
• 蛋白质合成的模板：mRNA
• 转运氨基酸的载体：tRNA • 蛋白质合成的能量来源：ATP、GTP
核糖体 ribosome
• rRNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白质复合物； • 细胞中大量存在； • 原核生物核糖体，真核生物细胞质核糖体和细胞 器核糖体； • 大小两个亚基组成； • 小亚基解码mRNA的信息，大亚基将氨基酸通过 肽键连接；
34
核糖体与mRNA类似物、tRNA（结合在P、 E位点）一起获得的结晶衍射结果表明：核糖体 中的rRNA 而不是蛋白质，在30S亚基解码时与 tRNA相互作用中以及50S亚基的肽键形成过程 中起主要作用。
编码链
模板链
转录
翻译
转录过程
• 起始 initiation；
• 延伸 elongation；
• 终止 termination；
转录起始
• 起始阶段包括：RNA聚合酶对DNA模板特定位
置的识别、结合，DNA双链的局部解螺旋，以
及最初几个磷酸二酯键的形成。
• 启动子（promoter）：转录起始阶段涉及的全 部DNA序列。
蛋白质合成的抑制剂：
氯霉素 链霉素 四环素
新霉素 红霉素 梭链孢酸 嘌呤霉素 白喉毒素 蓖麻毒素 放线菌酮
例题
• 翻译过程不可能发生在（）中： A. 神经细胞 B. 肝细胞 C. 成熟的红细胞 D.脂肪细胞
C
例题
人体中具有生长激素基因和血红蛋白基因，两者（）：
A. 分别存在于不同组织的细胞中
tRNA-AA + AMP
p.222
肽链起始
• 起始密码子 • 起始氨基酸 • 起始tRNA 起始氨基酸 起始tRNA 原核生物 真核生物
fMet
起始密码子 AUG AUG
tRNAfMet tRNAiMet
Met
起始密码子的识别
真核生物肽链起始：
• 起始氨酰tRNA不进行甲酰化； • 起始密码子的识别机制不同； • 起始复合物形成机制不同；
• DNA双链中的每一条链都包含合成互补链 所需要的全部信息；
• DNA的双螺旋结构和碱基互补配对原则为 复制提供了精确的模板。
2007 江苏模拟题
• 某双链DNA分子含有200个碱基，一条链上 A:T:G:C=1:2:3:4，则该DNA分子（）： A.含有4个游离的磷酸基； B.连续复制两次，需要游离的腺嘌呤脱氧核苷酸210 个； C.四种含氮碱基A:T:G:C=3:3:7:7；
• 全酶--2’ ω
• 核心酶-- 2’ ω ， 负责转录延伸； --负责转录起始；
• 不同种细菌中核心酶大小比较恒定，
因子变化较大。
• 细菌中的三种RNA由同一种RNA聚合酶转录。 • 噬菌体RNA聚合酶为单一多肽链，比较简单。
原核生物RNA聚合酶可以被 利福霉素（rifamycin） 抑制。
• 核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）;
• SD序列；
Shine-Dalgarno Sequences
• 原核生物 mRNA：通常为多顺反子
• 真核生物 mRNA：通常为单顺反子
tRNAs
• mRNA与氨基酸之间的adaptor • 1965年, Robert Holley完成了酵母丙氨酸 tRNA 的 序列测定；
真核生物RNA pol 的结构：
• 多亚基； • 有类似α、β、β’ 、ω的亚基； • 没有类似σ的亚基；
一种水生嗜热杆菌 的RNA聚合酶
“Crab claw”
酵母中RNA 聚合酶II
模板
• 只能是DNA双链中的一条； • ssDNA, RNA, RNA-DNA都不能作为模板；
实验证明： 测碱基组成---产生的RNA的碱基组成与编码链 DNA的碱基组成一致。 分子杂交实验---产生的RNA可以与模板DNA形 成杂交分子。
D.碱基排列方式共有4100种。
C
上海高考题
• 某DNA分子共有a个碱基，其中含胞嘧啶m个，则 该DNA分子复制3次，需要游离的胸腺嘧啶脱氧 核苷酸数为（）： A. 7(a-m)； B. 8(a-m)；
C.
；
D. 8(2a-m)。
C
基因表达
• 转录是基因表达的核心步骤；
• 翻译是基因表达的最终目的；
D
2008 广州模拟题
由n个碱基组成的基因，控制合成由一条多肽链组成 的蛋白质，氨基酸的平均分子量为a，则该蛋白质的 分子量最大为： A. na/6 C. na-18(n-1) B. na/3-18(n/3-1) D. na/6-18(n/6-1)
D
2008 江苏高考题
叶绿体的DNA能指导自身小部分蛋白质在叶绿 体内合成。下列叙述中错误的是： A. 叶绿体DNA能够转录
通过滤膜
放射性在滤液中
19AAs + [14C]-Phe and soluble aaRSs
ຫໍສະໝຸດ Baidu过滤膜
放射性在滤膜上
果蝇线粒体
哺乳动物线粒体
酵母线粒体
高等植物线粒体
tRNA的接头作用（adaptor）
蛋白质合成的过程
• • • • • 氨基酸活化； 肽链起始； 肽链延伸； 终止与释放； 修饰加工；
Bacterial culture with 15N- DNA
收获细胞，重悬于14NH4Cl 为N 源的培养基中
14NH Cl 4
Bacterial culture with 15N- DNA
“0 代”
生长1代
继续培养
…
继续培养
收获部分2代细胞
收获部分1代细胞
分离收获细胞的DNA，进行CsCl密度梯度离心.然后进行UV分析
转录起点
• RNA链上掺入的第一个核苷酸通常是嘌呤：ATP or GTP；因此新生RNA的5’端通常为pppA or pppG；
原核生物的启动子
T85T83G81A61C69A52…... T89A89T50A65A65T100 “-35” spacer “-10”
• -10序列（also know as Pribnow box）：
④ 两者碱基配对的方式相同
A. 只有一种说法正确
C. 只有三种说法正确
B. 只有两种说法正确
D. 四种说法全部正确
A
2007 上海高考题
一个mRNA分子有m个碱基，其中G+C有n个，由该 mRNA合成的蛋白质有两条肽链。则其模板DNA分 子的A+T数、合成蛋白质时脱去的水分子数分别是： A. m、m/3-1 C. 2(m-n)、m/3-1 B. m、m/3-2 D. 2(m-n)、m/3-2
有助于DNA局部解开双螺旋； • -35序列： 提供RNA pol的识别信号；
其它启动子
转录延伸
核心酶; NusA 取代 σ; 转录泡： 17bp; RNA-DNA 杂交区： 9bp; 转录速度： 50 nt/s;
转录终止
• 终止子--提供转录终止信号的DNA序列；
真核生物转录过程
B. 叶绿体DNA是遗传物质
C. 叶绿体内存在核糖体
D. 叶绿体功能不受细胞核调控
D
2008 山东模拟题
• 利福霉素是从 链霉菌（streptomyces） 中分离得到 的一种抗生素，可以与细菌RNA pol的β亚基直接结合， 抑制三或第四个核苷酸的参入。 • 人工合成的利福平 rifampicin，可供口服，用于细菌 感染的临床治疗。
真核生物RNA聚合酶
核仁
核质
放线菌素D阻止转录延伸； RNA pol I对放线菌素D最敏感；
真核生物细胞质核糖体结构比原核生物复杂得多； 真核生物细胞器核糖体结构比原核生物更简单；
核糖体循环
小亚基
+
大亚基
核糖体
多核糖体
形成多聚核糖体可以提高翻译的效率
mRNA
• 开放阅读框（open reading frame, ORF）; • 3’端、5’端非编码序列（non-coading sequence, NCS）,非翻译区（untranslated region, UTR）;
• 至1969年，测定了14种tRNA的序列;
• 都有共同的三叶草结构 “cloverleaf” ;
超过 70种 tRNA转运 20 种氨基酸
Isoaccepting tRNA (同工tRNA)--- 转运同 一种氨基酸的不同种tRNA
密码子(codon)与反密码子(anticodon)
• • mRNA上的核苷酸排列顺序称为遗传密码。 mRNA上每三个相邻的核苷酸构成密码子。
氨基酸活化
aa + tRNA + ATP aa-tRNA + AMP + PPi
*氨酰-tRNA合成酶
Aminoacyl-tRNA Synthetases
Two-step Reaction equation:
1) ATP + amino acid (AA)
2) tRNA + AMP-AA
AMP-AA + PPi
基因表达
转录 翻译
逆转录
复制 复制
中心法则
DNA的复制
DNA可能的复制方式
DNA半保留复制的实验证明
Matthew Meselson and Franklin Stahl (1958) 大肠杆菌（E. coli）DNA标记实验
Bacterial culture
培养几代
15NH Cl 4
编码链
模板链
转录
翻译
转录 transcription
• 在DNA指导下（以DNA为模板）合成RNA的 过程称为转录。 • RNA聚合酶
RNA聚合酶
NTPs RNA + PPi
模板：DNA；
引物：不需要；
底物：NTP； 合成方向：5’3’； 辅助因子：Mg2+
E.coli RNA 聚合酶
其它密码子
• •
ACACACACACAC….. UGUGUGUGUGUGU…… ACA CAC ACA CAC UGU GUG UGU GUG
更复杂的密码子
•
核糖体结合实验
Phe
核糖体
AAA UUU
Triplet RNA
设立20个不同的反应管，每一个含有一种放射性标记的氨基酸
19AAs + [14C]-Pro and soluble aaRSs
• 起始因子不同；
扫描机制
p.245
还需要：
Kozak’s rules: 一致序列
CCRCCAUGG
-3 +4
肽链延伸
翻译的极性（肽链延伸的方向） 1) 从N端 → C端 2) mRNA阅读方向： 5’ → 3’
氨酰tRNA进位
形成肽键
肽酰转移酶
23s rRNA
转位
终止与释放
终止密码子: amber codon (琥珀型)--- UAG ochre codon (赭石型)--- UAA opal codon (乳石型)--- UGA
•
tRNA反密码环上的三个相邻的核苷酸构成反密码子。
密码子的破译
体外翻译系统
无细胞抽提液 •核糖体 •tRNAs •氨基酸 •酶 •ATP, GTP
+ mRNA =
实验过程: • 设立 20 个反应管 • 每个反应管中加入一种放射性标记的氨基酸 • 加入 poly-U RNA • 酸沉淀回收合成的蛋白质 • 观察哪一个反应管中产生带有放射性标记的酸沉淀？
实验结果预测
实验结果及分析
(CsCl 梯度离心) N15
DNA
N14
半保留复制
M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
结果示意图
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分
别以每条单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基
可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代 DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。
实验结果：
• •
poly-U产生多聚苯丙氨酸（polyphenylalanine）
UUU=Phe Poly-A 产生 polylysine (AAA = Lys) Poly-C 产生 polyproline (CCC = Pro)
用其它mRNA进行同样的实验：
• •
•
Poly-G 产生 polyglycine (GGG = Gly)
B. 均在细胞分裂前期按照碱基互补配对原则复制
C. 均在细胞核内转录和翻译
D. 转录的信使RNA上相同的密码子翻译成相同的氨基 酸 D
2007 南京模拟题
转录和翻译是真核细胞中基因表达的两个重要步骤， 判断下列有关叙述（）： ① 两者需要的原料不同 ② 两者所需酶的种类相同
③ 两者在同一场所中进行
真核生物的启动子
• 三种RNA pol；
• 不同的RNA pol识别不同的启动子； • 需要转录因子(TF)；
翻译
以mRNA为模板，合成蛋白质的过程
称为翻译 (translation)。
• 蛋白质合成的场所：核糖体 • 蛋白质合成的原料：氨基酸
• 蛋白质合成的模板：mRNA
• 转运氨基酸的载体：tRNA • 蛋白质合成的能量来源：ATP、GTP
核糖体 ribosome
• rRNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白质复合物； • 细胞中大量存在； • 原核生物核糖体，真核生物细胞质核糖体和细胞 器核糖体； • 大小两个亚基组成； • 小亚基解码mRNA的信息，大亚基将氨基酸通过 肽键连接；
34
核糖体与mRNA类似物、tRNA（结合在P、 E位点）一起获得的结晶衍射结果表明：核糖体 中的rRNA 而不是蛋白质，在30S亚基解码时与 tRNA相互作用中以及50S亚基的肽键形成过程 中起主要作用。
编码链
模板链
转录
翻译
转录过程
• 起始 initiation；
• 延伸 elongation；
• 终止 termination；
转录起始
• 起始阶段包括：RNA聚合酶对DNA模板特定位
置的识别、结合，DNA双链的局部解螺旋，以
及最初几个磷酸二酯键的形成。
• 启动子（promoter）：转录起始阶段涉及的全 部DNA序列。
蛋白质合成的抑制剂：
氯霉素 链霉素 四环素
新霉素 红霉素 梭链孢酸 嘌呤霉素 白喉毒素 蓖麻毒素 放线菌酮
例题
• 翻译过程不可能发生在（）中： A. 神经细胞 B. 肝细胞 C. 成熟的红细胞 D.脂肪细胞
C
例题
人体中具有生长激素基因和血红蛋白基因，两者（）：
A. 分别存在于不同组织的细胞中
tRNA-AA + AMP
p.222
肽链起始
• 起始密码子 • 起始氨基酸 • 起始tRNA 起始氨基酸 起始tRNA 原核生物 真核生物
fMet
起始密码子 AUG AUG
tRNAfMet tRNAiMet
Met
起始密码子的识别
真核生物肽链起始：
• 起始氨酰tRNA不进行甲酰化； • 起始密码子的识别机制不同； • 起始复合物形成机制不同；
• DNA双链中的每一条链都包含合成互补链 所需要的全部信息；
• DNA的双螺旋结构和碱基互补配对原则为 复制提供了精确的模板。
2007 江苏模拟题
• 某双链DNA分子含有200个碱基，一条链上 A:T:G:C=1:2:3:4，则该DNA分子（）： A.含有4个游离的磷酸基； B.连续复制两次，需要游离的腺嘌呤脱氧核苷酸210 个； C.四种含氮碱基A:T:G:C=3:3:7:7；
• 全酶--2’ ω
• 核心酶-- 2’ ω ， 负责转录延伸； --负责转录起始；
• 不同种细菌中核心酶大小比较恒定，
因子变化较大。
• 细菌中的三种RNA由同一种RNA聚合酶转录。 • 噬菌体RNA聚合酶为单一多肽链，比较简单。
原核生物RNA聚合酶可以被 利福霉素（rifamycin） 抑制。
• 核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）;
• SD序列；
Shine-Dalgarno Sequences
• 原核生物 mRNA：通常为多顺反子
• 真核生物 mRNA：通常为单顺反子
tRNAs
• mRNA与氨基酸之间的adaptor • 1965年, Robert Holley完成了酵母丙氨酸 tRNA 的 序列测定；
真核生物RNA pol 的结构：
• 多亚基； • 有类似α、β、β’ 、ω的亚基； • 没有类似σ的亚基；
一种水生嗜热杆菌 的RNA聚合酶
“Crab claw”
酵母中RNA 聚合酶II
模板
• 只能是DNA双链中的一条； • ssDNA, RNA, RNA-DNA都不能作为模板；
实验证明： 测碱基组成---产生的RNA的碱基组成与编码链 DNA的碱基组成一致。 分子杂交实验---产生的RNA可以与模板DNA形 成杂交分子。
D.碱基排列方式共有4100种。
C
上海高考题
• 某DNA分子共有a个碱基，其中含胞嘧啶m个，则 该DNA分子复制3次，需要游离的胸腺嘧啶脱氧 核苷酸数为（）： A. 7(a-m)； B. 8(a-m)；
C.
；
D. 8(2a-m)。
C
基因表达
• 转录是基因表达的核心步骤；
• 翻译是基因表达的最终目的；
D
2008 广州模拟题
由n个碱基组成的基因，控制合成由一条多肽链组成 的蛋白质，氨基酸的平均分子量为a，则该蛋白质的 分子量最大为： A. na/6 C. na-18(n-1) B. na/3-18(n/3-1) D. na/6-18(n/6-1)
D
2008 江苏高考题
叶绿体的DNA能指导自身小部分蛋白质在叶绿 体内合成。下列叙述中错误的是： A. 叶绿体DNA能够转录
通过滤膜
放射性在滤液中
19AAs + [14C]-Phe and soluble aaRSs
ຫໍສະໝຸດ Baidu过滤膜
放射性在滤膜上
果蝇线粒体
哺乳动物线粒体
酵母线粒体
高等植物线粒体
tRNA的接头作用（adaptor）
蛋白质合成的过程
• • • • • 氨基酸活化； 肽链起始； 肽链延伸； 终止与释放； 修饰加工；
Bacterial culture with 15N- DNA
收获细胞，重悬于14NH4Cl 为N 源的培养基中
14NH Cl 4
Bacterial culture with 15N- DNA
“0 代”
生长1代
继续培养
…
继续培养
收获部分2代细胞
收获部分1代细胞
分离收获细胞的DNA，进行CsCl密度梯度离心.然后进行UV分析
转录起点
• RNA链上掺入的第一个核苷酸通常是嘌呤：ATP or GTP；因此新生RNA的5’端通常为pppA or pppG；
原核生物的启动子
T85T83G81A61C69A52…... T89A89T50A65A65T100 “-35” spacer “-10”
• -10序列（also know as Pribnow box）：
④ 两者碱基配对的方式相同
A. 只有一种说法正确
C. 只有三种说法正确
B. 只有两种说法正确
D. 四种说法全部正确
A
2007 上海高考题
一个mRNA分子有m个碱基，其中G+C有n个，由该 mRNA合成的蛋白质有两条肽链。则其模板DNA分 子的A+T数、合成蛋白质时脱去的水分子数分别是： A. m、m/3-1 C. 2(m-n)、m/3-1 B. m、m/3-2 D. 2(m-n)、m/3-2
有助于DNA局部解开双螺旋； • -35序列： 提供RNA pol的识别信号；
其它启动子
转录延伸
核心酶; NusA 取代 σ; 转录泡： 17bp; RNA-DNA 杂交区： 9bp; 转录速度： 50 nt/s;
转录终止
• 终止子--提供转录终止信号的DNA序列；
真核生物转录过程
B. 叶绿体DNA是遗传物质
C. 叶绿体内存在核糖体
D. 叶绿体功能不受细胞核调控
D
2008 山东模拟题
• 利福霉素是从 链霉菌（streptomyces） 中分离得到 的一种抗生素，可以与细菌RNA pol的β亚基直接结合， 抑制三或第四个核苷酸的参入。 • 人工合成的利福平 rifampicin，可供口服，用于细菌 感染的临床治疗。
真核生物RNA聚合酶
核仁
核质
放线菌素D阻止转录延伸； RNA pol I对放线菌素D最敏感；
真核生物细胞质核糖体结构比原核生物复杂得多； 真核生物细胞器核糖体结构比原核生物更简单；
核糖体循环
小亚基
+
大亚基
核糖体
多核糖体
形成多聚核糖体可以提高翻译的效率
mRNA
• 开放阅读框（open reading frame, ORF）; • 3’端、5’端非编码序列（non-coading sequence, NCS）,非翻译区（untranslated region, UTR）;
• 至1969年，测定了14种tRNA的序列;
• 都有共同的三叶草结构 “cloverleaf” ;
超过 70种 tRNA转运 20 种氨基酸
Isoaccepting tRNA (同工tRNA)--- 转运同 一种氨基酸的不同种tRNA
密码子(codon)与反密码子(anticodon)
• • mRNA上的核苷酸排列顺序称为遗传密码。 mRNA上每三个相邻的核苷酸构成密码子。
氨基酸活化
aa + tRNA + ATP aa-tRNA + AMP + PPi
*氨酰-tRNA合成酶
Aminoacyl-tRNA Synthetases
Two-step Reaction equation:
1) ATP + amino acid (AA)
2) tRNA + AMP-AA
AMP-AA + PPi