重组肠激酶和目的蛋白的分离纯化方案
小鼠肠激酶的分离纯化
1.基因工程药物工艺与质控：
基因工程药物工艺研究包括工程菌构建与分析、发酵工艺（上游工艺）研究、分离纯化工艺（下游工艺）研究 和制剂工艺研究等内容，质控研究则贯穿于工程菌构建和上、下游工艺研究的全过程，并以工程菌菌种库、半 成品原液和成品为主要质控点。
生产菌种
菌种活化
种子液制备
发酵
离心收菌
粗提
精纯
除菌
03 肠激酶
来源：最早的肠激酶是从牛小肠提取出来的。 定义：肠激酶（Enterokinase，EK）是一种哺乳动物十二指肠粘膜细胞所分泌的丝氨酸蛋白酶，在
肠道中能将胰蛋白酶原N端的六肽水解掉，从而形成有活性的胰蛋白酶。该酶又称为肠肽酶 （Enteropeptidase）
结构：肠激酶由轻重两条链通过链间的二硫键结合在一起。重链又称为结构亚基，能将肠激酶锚定在
小肠刷状缘膜上，并将它引向肠腔。轻链又称为催化亚基，拥有全酶的活性，是切割位点的识别者和 催化功能的执行者。
03 肠激酶
酶学特性：
专一性和高效性 特异性 稳定性 易保存
特异性识别天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨 酸序列（DDDDK序列），并降解赖氨酸后面的肽键
室温（25 ℃）放置，一周内无活性损失。 若-20℃保存，保存期可达24个月
重组肠激酶的应用
作为一种高效、特异的丝氨酸蛋白酶，肠激酶可以高效专一性地切割工程菌表达的融合蛋 白，从而释放出目的蛋白，因此在生物制药领域、生命科学研究领域已成为融合蛋白切割首 选的工具酶。过生物工程的手段来制备肠激酶的轻链蛋白，已是目前获取肠激酶的主要方式。
广义的基因工程包括外源基因的克隆、表达载体和外源基因表达系统的构建、表达生产（发酵）和分离纯化等 过程。 外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。原核表达系统主要是大肠杆菌系统，真核表达系统 主要有毕赤酵母（Pichia pastoris）系统和哺乳动物细胞CHO系统。
肠激酶的重组表达
上海雅心生物技术有限公司上海雅心生物技术有限公司2017重组肠激酶Cat.No.:REK08CAS:9017-74-8EC:3.4.21.9来源：牛肠激酶，重组大肠杆菌表达1.简介雅心重组牛肠激酶是一种高纯度的重组牛肠激酶轻链片段。
该酶经HPLC 纯化，纯度高，特异性高，并且不含其他蛋白酶。
肠激酶是一个特定的蛋白酶，它可以切割前面含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端位点：天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸。
肠激酶可去除位于蛋白质N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合标签。
2.优势1）特定的蛋白酶，切割前面含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端位点：天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(DDDDK)。
2）不含其他蛋白酶,无非特异性切割。
3.酶切条件按照酶活性定义，酶切条件举例：25mM Tris-HCl8.0体系中：融合蛋白浓度0.1-1mg/ml（蛋白总量50-100µg）重组EK用量0.1-0.2U温度25℃过夜酶切，或完全酶切需要16h左右。
4.常见影响肠激酶活性的因素在＞200mM咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影响。
可参照以下推荐方法进行酶切：1）为获得理想酶切结果，请将样品透析到25mM Tris-HCl8.0缓冲液中，再进行酶切。
2）若不便透析，可将样品稀释，咪唑含量在100mM以下，NaCl浓度在50mM以下，甘油浓度小于5%以下进行酶切，酶的用量与蛋白的比例不变（即1U酶切500µg蛋白）。
3）如果样品溶液中含有上述成分中的一种或多种，且不便去除，此时适当增加酶量或延长酶切时间，也可达到较好酶切效果。
5.特性重组大肠杆菌分子量25,850Da活性1U定义为在25℃，12h~16h之内，将500µg保存于25mM Tris-HCl8.0缓冲液中的融合蛋白切割95%所需的酶量储存-20℃稳定性可以在常温下运输，在25℃可稳定保存一周。
蛋白质表达及纯化策略
蛋白表达及纯化策略一.目录：含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二.试剂：所用试剂均购自上海生工三.资料来源：汪德强老师四.撰写：罗淼牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。
将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。
通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。
生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。
生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。
低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。
IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。
所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。
直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
酶蛋白的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
(完整版)1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验
第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。
调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。
分装成15瓶（每瓶200ml）。
2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。
37℃过夜。
第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。
2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。
25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。
注意配平。
4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。
将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。
离心收集上清液。
600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。
超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。
探头浸没于菌液中，不可伸入过长。
注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。
5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。
将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。
第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。
2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。
3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。
用洗脱液调零，测OD280。
（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。
基因重组蛋白纯化流程
01.11周总结一、本周工作01．0520T—TB23蛋白处理1、分析昨天20T—TB23蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M、8M溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M尿素去杂蛋白，用6M尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,再重复一遍；4、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml的5*loadingbuffer,取40微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3微升样品，进行电泳；20T—I56II12菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620T—TB23蛋白回收：1.将跑20T—TB23蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD值为0.165,260nmOD值为0.098，C=（0.165*1.45—0.098*0.74）*12=2.0；20T—I56II12蛋白处理：1用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24倍测蛋白浓度，280nmOD值为1.041,260nmOD值为0.579，C=（1.041*1.45—0.579*0.74）*24=25.9；往上清中加2.6ml的5*loadingbuffer,取40微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3微升样品，共加4板，进行电泳01.07协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12蛋白1．准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上（不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好）；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm 左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min；7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4°C保存。
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重组肠激酶和目的蛋白分离纯化推荐方案
重组肠激酶专为切割重组表达融合蛋白设计，分为两个类型：rEK-B 和rEK-H ，分别为不含有His-6和含有His-6 重组标签。
雅心生物目前生产的为rEK-B。
不含His标签，相对比活高，约为20000 Unit/mg pro，按照活性定义，1 Unit 可以切割0.5mg目的蛋白，则酶切液中的重组肠激酶相对于目的蛋白的含量为万分之一（0.01%）。
所以，在进一步的实验中，可以不考虑其对下游实验的影响，建议可以不纯化。
如果确实需要去除rEK，建议的去除方法如下：
✧如果使用亲和层析，可以利用胰蛋白酶抑制剂亲和胶，由于肠激酶是一种丝氨酸蛋
白酶，胰蛋白酶抑制剂可以与肠激酶结合，从而达到纯化目的。
建议利用离子交换层析分离去除微量的肠激酶。
✧PH8.0条件下，肠激酶与DEAE胶结合，并且在0.15M NaCl中可以被洗脱。
可以
利用目的蛋白与肠激酶电荷以及与DEAE胶的结合以及洗脱的不同条件将二者进行分离。