2010 第二章 第三节 培养基灭菌
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培养基灭菌的目的和要求
培养基灭菌的目的和要求
残留的活菌含量
54℃
1 0-1
1 0-2
56℃
1 0-3
1 0 -4 1 0-5
0
58℃ 60℃
24
6 8 10 t(min)
图 2-1 大 肠 杆 菌 在 不 同 温 度 下 的 死 亡 曲 线
培养基灭菌的目的和要求
– 活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件
相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。 ∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量， 值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越 敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数 。 – 不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。 – 对（4）两边取对数，得
2、连续灭菌流程及设备
即在培养基输 送至发酵罐 的同时进行 加热、保温 和冷却而进 行的灭菌。
培养基灭菌的目的和要求
（1）连消塔-喷淋冷却连续灭菌 流程
（1）配料预热罐，将配好的料液预热到 60~70℃，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温 度相差过大而产生水汽撞击声；
（2）连消塔，是使高温蒸汽与料液迅速接触 混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度 （126~132℃）；
培养基灭菌的目的和要求
湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热； • 操作方便，易管理。
培养基灭菌的目的和要求
1.1 湿热灭菌的理论基础
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3），需要多高的温 度、多长的时/N0=10-16时，灭菌温度 对维生素B1破坏的影响
灭菌温度（˚C）
100 110 120 130 140 150
达到灭菌程度的时间 （min）
残留的活菌含量
54℃
1 0-1
1 0-2
56℃
1 0-3
1 0 -4 1 0-5
0
58℃ 60℃
24
6 8 10 t(min)
图 2-1 大 肠 杆 菌 在 不 同 温 度 下 的 死 亡 曲 线
培养基灭菌的目的和要求
– 活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件
相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。 ∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量， 值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越 敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数 。 – 不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。 – 对（4）两边取对数，得
2、连续灭菌流程及设备
即在培养基输 送至发酵罐 的同时进行 加热、保温 和冷却而进 行的灭菌。
培养基灭菌的目的和要求
（1）连消塔-喷淋冷却连续灭菌 流程
（1）配料预热罐，将配好的料液预热到 60~70℃，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温 度相差过大而产生水汽撞击声；
（2）连消塔，是使高温蒸汽与料液迅速接触 混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度 （126~132℃）；
培养基灭菌的目的和要求
湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热； • 操作方便，易管理。
培养基灭菌的目的和要求
1.1 湿热灭菌的理论基础
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3），需要多高的温 度、多长的时/N0=10-16时，灭菌温度 对维生素B1破坏的影响
灭菌温度（˚C）
100 110 120 130 140 150
达到灭菌程度的时间 （min）
第二章_培养基灭菌解析
第一节 分批灭菌
一、微生物的死灭动力学 灭菌时间、灭菌温度是热力灭菌的主要 影响因素。
(一)微生物热死灭动力学方程
生物工程专业课程
生 化 工 程 第 二 章 培 养 基 灭 菌
微生物的热阻 表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。 是指微生物在某一特定条件(主要是温度和 加热方式)下的致死时间。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围， 如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多 数微生物的最适温度为25～37℃；另有一些 嗜热菌的最适温度为50～60℃。
用 N表示活菌个数，则活菌的减少率(死亡 率)与N呈线性关系，即：
dN KN dt
生物工程专业课程
生 化 工 在恒定温度下，将方程积分，边界条件为： 程 t：t = 0 → t = t；N：N = N → N = N； 0 0 第 N dN t N 二 K dt ln Kt N0 N t0 N0 章 培 养 基 灭 菌
N0 N1 N2 ln ln ln N1 N2 N
即整个灭菌过程由三块积分面积构成。其 中升、降温阶段的温度是时间的函数。
生物工程专业课程
N0 生 E RT 将 K Ae 代入 ln K t ，得： 化 N 工 rising ： 程
第 一 章 培 养 基 灭 菌
t1 N0 ln A e E RT dt N1 0
K(min-1)
D
嗜热脂肪芽孢杆菌
维生素B1
C B A
1/T(K) b a
当温度从a→b时 维生素的K破坏增 加为A→B；而芽 孢杆菌K死灭增加 为C→D；其增加 幅度远大于维生 素的；
生物工程专业课程
生 化 工 程 第 一 章 培 养 基 灭 菌
培养基灭菌
培养基灭菌（包括发酵设备及其管路灭菌），应做到营养物破坏最少，残存的杂菌不影响到生物反应，蒸汽量最少，而根据实际生产条件变动灭菌条件。
①分批灭菌温度和灭菌时间，应根据培养基的成分、物理状态、酸碱度、杂菌的生长状态、数量蒸汽的压力、流量、设备的热交换效果等加以确定。
培养基灭菌（包括发酵设备及其管路灭菌），应做到营养物破坏最少，残存的杂菌不影响到生物反应，蒸汽量最少，而根据实际生产条件变动灭菌条件。
①分批灭菌温度和灭菌时间，应根据培养基的成分、物理状态、酸碱度、杂菌的生长状态、数量蒸汽的压力、流量、设备的热交换效果等加以确定。
另外还要顾及升温和降温过程的灭菌作用，需先确定小型发酵罐的升温时间和降温时间，然后确定几何形状和热交换方式相同的大型发酵罐的升温和降温时间，在确定大型发酵罐的维持过程的时间。
②为使料液得到彻底灭菌，设备应避免积垢、渗漏和存在“死角”，还应尽可能减少泡沫。
如果泡沫较多，覆盖液面，必须增加进气量，间歇升压，促使料液大幅度翻动，露出液面，以便较好地杀灭泡沫中杂菌。
③为使设备及其管路彻底灭菌，应使用具有足够压力的饱和蒸汽，避免夹带大量冷凝水，确保排气口压力达100kp以上。
④在保证灭菌合格的前提下，还应在停止进汽的即刻用无菌空气进行保压，防止设备及管路内压力迅速下降，导致外界空气从渗漏处窜入。
无菌空气的压力应大于100kp。
⑤升压过程不可急剧进汽，以利于节约灭菌用气和减少泡沫。
,以杀死不耐热的细卷糖、降血压和防癌，以杀死不耐热的酵母和细菌不行。
豆腐乳中已经没有活的红曲霉了。
豆腐乳在生产时，是用红曲霉的，红曲霉生长，产生蛋白酶分解豆腐中的蛋白质。
然后加盐密封，在高盐和无氧环境中，红曲霉死亡，只留下红色素。
所以从豆腐乳中分离纯化红曲霉是不可行的。
第二章_培养基灭菌1
不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A e 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
例：
嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 和 维 生 素 B1 的 热 处 理 数 据 （一定 T 下， ln(N/N0 ) = - K t ），就不同的 T，求 得前者的比热死亡速率常数 KBS 和后者的比破坏速率常 数 KVB， 按 lnK——1/T 标 会 ， 得图，由图算出： • △EBS=67000×4.184 J/mol • △EVB=22000×4.184 J/mol • ln K = - △E /RT + ln A
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度 T 对 K 的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度 和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A e
E / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol· K T：绝对温度
进行培养基灭菌的操作方式 • 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌
第三章 培养基灭菌
3） 抗生素
（1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或 ）抗生素： 其衍生物， 其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物的 生命活动。 生命活动。 （2）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围， ）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围， 将这一范围称该抗生素的抗菌谱。 将这一范围称该抗生素的抗菌谱。 广谱：对多种微生物有作用（四环素G+， 广谱：对多种微生物有作用（四环素G+， G-） ） 窄谱：仅对某一类微生物有作用（ 窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素 G+） ） （3）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标 ）效价：抑菌圈大小，生物活性单位， 准曲线
（5）氧化剂类： 氧化剂类： 机理：破坏蛋白质的巯基， 机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋 白质的氨基与酚羟基 I： KI，溶于100ml 95%乙醇 乙醇。 碘酒 7g I：5g KI，溶于100ml 95%乙醇。 1%碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌 碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌， 1%碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌， 并使流感病毒灭活。 并使流感病毒灭活。 漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物） 漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）
3、射线灭菌法： 射线灭菌法： 1）电离辐射：χ、γ、β射线 。 ）电离辐射： 、 、 射线 引起水和其他物质的电离， 原理 ：引起水和其他物质的电离，产生 游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。 游离基，破坏 ，从而造成细胞损伤。 特点；穿透力强，无专一性，对所有生 特点；穿透力强，无专一性， 物均有杀伤作用。 物均有杀伤作用。 适用：菌种诱变。 适用：菌种诱变。
2）非电离辐射（紫外线） ）非电离辐射（紫外线） 方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。 方法：在波长 处 杀菌力最强。 原理： 原理： 使同链DNA相邻嘧啶间形 （1）作用于 ）作用于DNA ，使同链 相邻嘧啶间形 成嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常 结构变形， 成嘧啶二聚体，引起 结构变形 的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（ 。（光 的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光 复活酶可修复） 复活酶可修复） （2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。 ）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。 适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。 适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。 特点：穿透力差。 特点：穿透力差。
2010 第二章 第三节 培养基灭菌
25
例 6 将例 2.4的间歇灭菌过程改为连 消： 2. 有一发酵罐，内装培养 基 40立方米，设每毫升培养 基中含有耐热的芽孢 2 × 10 7 个， 连续灭菌的温度为 131℃，此时的灭菌速度常 数为0.25 秒 −1，试求灭菌失败的 几率为0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。
间接直接加热阶段的加热所需时间间接直接加热阶段的蒸汽耗量二者公式相同结果相加即是升温时的蒸汽总耗量是变化的一般夹套时在不稳定传热过程中温度结束加热时培养基的温度开始加热时培养基的加热蒸汽温度热系数千卡加热过程中的平均传公斤培养基比热千卡培养基重量公斤加热所需时间小时其中间接加热的加热时间计4503003002002f2sc一般取1即按水的比热
第二章
培养基制备
液体培养基的灭菌
第三节
1
一
概述
发酵过程中灭菌的方法： 化学物质灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、 辐射灭菌、过滤介质除菌
石炭酸 （苯酚 ）： 来苏尔： 2%~5%，器械、环境的喷雾消毒 2%，皮肤消毒
新洁尔灭 （苯扎溴铵 ）：0.25%，无菌室喷雾消毒，皮肤器械表面消毒 甲醛： 漂白粉： 气体挥发杀菌，处理 染菌罐 染菌罐、厂房定期消毒 10%，环境、车间下水道、地沟等污染源消毒
但小罐（ 以下）实际生产中不考虑， 但小罐（ 40m3以下）实际生产中不考虑，保险一些 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失， 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失，应考虑此影响 计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书） （计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书）
14
4 保温阶段的蒸汽耗量 在保温阶段，活蒸汽仍不断通入发酵罐，由发酵罐顶若 干出口排出 此段蒸汽耗量可估算为： 直接加热的蒸汽耗量的30直接加热的蒸汽耗量的30-50% 30 40m3以上的罐，取30%， 40m3以下的罐，取50% 如，一个10m3的罐，升温时直接加热用蒸汽1.6吨， 则保温时用约0.5-0.8吨。
例 6 将例 2.4的间歇灭菌过程改为连 消： 2. 有一发酵罐，内装培养 基 40立方米，设每毫升培养 基中含有耐热的芽孢 2 × 10 7 个， 连续灭菌的温度为 131℃，此时的灭菌速度常 数为0.25 秒 −1，试求灭菌失败的 几率为0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。
间接直接加热阶段的加热所需时间间接直接加热阶段的蒸汽耗量二者公式相同结果相加即是升温时的蒸汽总耗量是变化的一般夹套时在不稳定传热过程中温度结束加热时培养基的温度开始加热时培养基的加热蒸汽温度热系数千卡加热过程中的平均传公斤培养基比热千卡培养基重量公斤加热所需时间小时其中间接加热的加热时间计4503003002002f2sc一般取1即按水的比热
第二章
培养基制备
液体培养基的灭菌
第三节
1
一
概述
发酵过程中灭菌的方法： 化学物质灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、 辐射灭菌、过滤介质除菌
石炭酸 （苯酚 ）： 来苏尔： 2%~5%，器械、环境的喷雾消毒 2%，皮肤消毒
新洁尔灭 （苯扎溴铵 ）：0.25%，无菌室喷雾消毒，皮肤器械表面消毒 甲醛： 漂白粉： 气体挥发杀菌，处理 染菌罐 染菌罐、厂房定期消毒 10%，环境、车间下水道、地沟等污染源消毒
但小罐（ 以下）实际生产中不考虑， 但小罐（ 40m3以下）实际生产中不考虑，保险一些 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失， 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失，应考虑此影响 计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书） （计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书）
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4 保温阶段的蒸汽耗量 在保温阶段，活蒸汽仍不断通入发酵罐，由发酵罐顶若 干出口排出 此段蒸汽耗量可估算为： 直接加热的蒸汽耗量的30直接加热的蒸汽耗量的30-50% 30 40m3以上的罐，取30%， 40m3以下的罐，取50% 如，一个10m3的罐，升温时直接加热用蒸汽1.6吨， 则保温时用约0.5-0.8吨。
培养基灭菌
湿热灭菌中的相关定义
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死 温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死 时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间 愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件 （主要是温度和加热方式）下的致死时间。相 对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间 与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
微生物细胞中水分对灭菌的影响 – 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 – 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 空气排除情况对灭菌的影响 搅拌对灭菌的影响 泡沫对灭菌的影响
三、培养基和设备灭菌
一、无菌的标准 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝 对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此 在工程设计中常取N=10-3
2、分批灭菌的优缺点 优点 – 设备投资较少 – 染菌的危险性较小 – 人工操作较方便 – 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点 – 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波 动大，一般只限于中小型发酵装置。
发酵罐的灭菌
培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵 罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通 常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气 分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排 气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤， 20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌 空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入 带菌的空气。
连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程
3、连续灭菌设备的结构 （1）设备结构： • 是培养液高温短时间 连续灭菌设备，它与维 持罐组成连续灭菌系统， 分套管式和汽液混合式 两类。
汽液混合式连消塔
• 维持罐 ������ 灭菌系统中的 维持设备，主要是 使加热后的培养基 在维持设备中保温 一段时间，以达到 灭菌的目的，也称 保温设备
第二章 培养基灭菌
热塔里停留20～30 s。
塔式加热器的导入管和外套管的管径、塔高和导入管 壁上的小孔数目可按下列公式计算：
少，灭菌效果可靠，灭菌用蒸汽要求低(0.2～0.3 MPa表 压)，但灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大， 操作难于自动控制。 分批灭菌是中小型发酵罐常采用的菌在发酵罐中进行。 将培养基在配料罐中配制好，经专用管道泵入发 酵罐，开始灭菌。
通用发酵罐常见管路一般有： 空气管和排气管，取样管， 出料管，接种管，消沫剂管，补 料管等。 发酵罐夹套或蛇管，采用间 壁传热而与发酵罐内部不相通。
2) 保温阶段的热量计算
3) 降温阶段的热量计算
①、升温阶段
A、采用蒸汽通入夹套或蛇管方式加热
B、直接蒸汽加热
升温阶段的灭菌度：
附：
升温阶段灭菌度的简易算法：
②、保温阶段 在此阶段，蒸汽仍不断通人发酵罐，而由发酵罐的若 干排气排出。此时蒸汽消耗量可用下式估算。
s = 1.19Ft P
v
④ 、改变反应介质pH值，使生化反应异常；
⑤ 、噬菌体污染，菌体裂解，生产失败等。
保证纯种培养的具体措施： ① 、设备灭菌并确保无泄漏； ②、 培养基灭菌； ③ 、通入气体(如空气)先除菌；
④ 、确保纯种；
⑤ 、补料应经灭菌
第一节 灭菌方法
常用方法： 化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌 、湿热灭菌 、
引入无菌空气。随后引入冷却水，降至培养温度。
(2)、分批灭菌的计算
分批灭菌的过程包括升温、保温和降温三个阶段。
升温：可夹套蒸汽加热，也可直接将蒸汽通入罐中，或 二者兼用。但后者会因冷凝水的加入改变消后体积。
保温：是灭菌的主要时段。习惯上，把保温时间看为灭
菌时间。 降温：灭菌后用冷却水冷却至培养温度。
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6
实罐灭菌的有关计算
蒸汽用量 灭菌时间 冷却水量 冷却时间
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实罐灭菌计算
灭菌升温 分两个时期 蒸汽间接加热 间接加热到70-95℃左右，再直接加热至 再直接加热至121 ℃ 间接加热 再直接加热至 工厂设计时，对升温阶段，主要计算： 间接、直接加热阶段的 加热所需时间 间接、直接加热阶段的 蒸汽耗量（二者公式相同，结果 相加即是升温时的蒸汽总耗量）
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例 6 将例 2.4的间歇灭菌过程改为连 消： 2. 有一发酵罐，内装培养 基 40立方米，设每毫升培养 基中含有耐热的芽孢 2 × 10 7 个， 连续灭菌的温度为 131℃，此时的灭菌速度常 数为0.25 秒 −1，试求灭菌失败的 几率为0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。
2 为25℃，用 2公斤 /厘米（表压）的蒸汽经蛇管 间接加热至 90℃，取 K＝400 千卡 /米 2 ⋅ 小时 ⋅ ℃，
C ＝1千卡 /公斤 ⋅ ℃，求此升温阶段的加 热时间及蒸汽用量？ 若用10℃的冷却水，将培养基 从120℃降到 30℃，已知发酵液 t 1 = 80℃时，冷却水出口温度 t 2 = 30℃，求灭菌的降温过程 中的冷却水用量，及冷 却时间。
但小罐（ 以下）实际生产中不考虑， 但小罐（ 40m3以下）实际生产中不考虑，保险一些 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失， 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失，应考虑此影响 计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书） （计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书）
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4 保温阶段的蒸汽耗量 在保温阶段，活蒸汽仍不断通入发酵罐，由发酵罐顶若 干出口排出 此段蒸汽耗量可估算为： 直接加热的蒸汽耗量的30直接加热的蒸汽耗量的30-50% 30 40m3以上的罐，取30%， 40m3以下的罐，取50% 如，一个10m3的罐，升温时直接加热用蒸汽1.6吨， 则保温时用约0.5-0.8吨。
空罐灭菌的蒸汽耗量 S (Kg) 有如下的估算：
S = V F × ρ S × 5倍左右 VF
:发酵罐的全容积 全容积，m3 全容积 :灭菌罐压下蒸汽的密度，kg/m3
ρS
5
（二）实罐灭菌（间歇灭菌）
操作： 进料完毕，开搅拌 开搅拌以防料液沉淀 开搅拌 开夹套蒸气阀，使料液预热升温至70-95℃,关搅拌 关搅拌 关闭夹套蒸气阀门，开空气、出料、取样三个阀门进 蒸气，开排汽阀，包括小辫子（进料管、补料管、接种 管）和排汽管。 升温至121 ℃，保温30min（实际上要计算确定） 保温结束，关过滤器排气阀、进汽阀，关夹套下水道 阀，开冷却水进水阀。 待罐压低于过滤器压力时，通入无菌空气，开搅拌 开搅拌， 开搅拌 降温至培养温度。
λ，加热蒸汽的热焓，千卡/公斤 是查表得的蒸汽供应温度 t1 下的热焓 t 3，蒸汽冷凝后的液体温度 直接加热时，为培养基的终温t2f，
间接加热时，为加热蒸汽的温度t1，此时分母值 即为温度为t1时水的汽化潜热
11
3. 保温灭菌时间 复习： 蒸汽湿热灭菌 理论灭菌时间
N0 1 τ= 2.303 log k Ns
17
2.冷却阶段计算 已知t 1s = 120℃，t 1f = 30℃，t 2s = 10℃，取C1＝C 2＝1千卡/公斤， 发酵液t 1 = 80℃时，冷却水出口温度t 2 = 30℃，则有： Β=e
KA WC 2
=
t 1 - t 2s 80 − 10 ＝ ＝1.4 t 1 - t 2 80 − 30
KA 400 × 30 故上式中的W可算出为：W = = = 35664公斤/小时＝35.66吨/小时 ln1.4 lnB 则冷却时间为： G ⋅ C1 τ＝ W ⋅ C2 Β t 1s - t 2s 28000 1.4 120 - 10 ＝ = 4.68小时 ln ln Β - 1 t 1f - t 2s 35664 0.4 30 - 10
解： N 0 = 40 × 10 6 × 2 × 10 7 = 8 × 1014 个 N s = 0.001个 N0 2.303 2.303 τ＝ log = log 8 × 1017 = 1436秒＝23.9分钟 K N s 0.0287
(
)
13
在实际灭菌中，在升温阶段就有部分杂菌被杀死，特别 是加热到100℃以后，此作用更明显，因此所需保温灭菌 时间比计算结果要小。 一般认为，灭菌时间可减少10%左右
18
（三）培养基连续灭菌流程
培养基连续灭菌的优点 高温瞬时灭菌，物料受热时间短，营养成分破坏少； 总的灭菌时间较实罐灭菌大为减少 蒸汽负荷均衡，可避免用气高峰，锅炉利用率高。
19
20
培养基连续灭菌的缺点
涉及设备多，能耗大 对总蒸汽压力要求高 操作繁杂 物料焦化结垢经常发生，要时常检查清理 培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少 时适用
15
5 实罐灭菌的冷却阶段的计算
此冷却过程属不稳定传 热，不像发酵阶段冷却 时，培养基温度不变， 此处 培养基温度也是渐降的 。 下式可用来计算冷却水 用量，或冷却时间
K，平均传热系数，千卡/平方米/小时/℃
KA
Β=e
WC 2
t 1 - t 2s = t1 - t 2
A, 传热面积，平方米 其中：
21
（三）培养基连续灭菌流程 系统：加热 加热（连消塔/喷射加热器）、维持 维持（维持 加热 维持 罐/维持管）与冷却 冷却（喷淋/薄板换热）三部分 冷却
与淀粉质原料的糖化流程的功能分工很像
操作过程：
先用蒸汽对整个工艺流程中的有关设备进行消毒，然后， 将底物或培养基连续通过设备进行消毒
22
（三）培养基连续灭菌流程
已知，查表得加热蒸汽温度t 1＝132.9℃，t 2s = 25℃，t 2f ＝90℃，
τ=
G ⋅ C t 1 - t 2s 28000 132.9 − 25 = 2.15小时 ln ＝ ln K ⋅ A t 1 - t 2f 400 × 30 132.9 − 90
蒸汽用量计算，取Q' 为加热量的5%，温度132.9℃时的蒸汽汽化潜热为 G ⋅ C(t 2f - t 2s ) + Q' 28000 ⋅ (90 − 25) S= ＝1.05 × ＝3688.5公斤＝3.69吨 518.1 λ - t3 518.1千卡/公斤（ = λ − t 3） ，则有
注意！ 注意！此公式中的温度符号与前加热 阶段的符号有重复，但意义不同的！ 阶段的符号有重复，但意义不同的！
t 1，培养基冷却过程中的 任一温度 t 2，培养基温度为 t 1时的冷却水的相应出口 温度。
16
例2.5 有一装量为 28 m 3的发酵罐，蛇管面积为 30 m 2，现进行实罐灭菌，培 养基原始温度
3
二
灭菌的实际操作
（一）空罐灭菌 也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是补料罐、消泡 罐，当物料未进罐前对罐进行的预先灭菌 空罐罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长 空罐罐灭菌要求温度较高， 通常空罐灭菌大都控制在 127-133 ℃（压力 0.150.2MPa），灭菌时间 30 -60 min。
4
空罐灭菌的蒸汽耗量
解： 1.升温阶段计算
4.2 若在 若在121度的保温阶段蒸汽耗量为 吨，不计 度的保温阶段蒸汽耗量为2.0吨 度ห้องสมุดไป่ตู้保温阶段蒸汽耗量为 热损失，则保温时产生的二次蒸汽（121度）有多少？ （已 热损失，则保温时产生的二次蒸汽（ 度 有多少？ 度时蒸汽的焓为650千卡 公斤，121度蒸汽的焓为 千卡/公斤 知132.9度时蒸汽的焓为 度时蒸汽的焓为 千卡 公斤， 度蒸汽的焓为 647千卡 公斤） 千卡/公斤 千卡 公斤）
去发酵 糖液 料 液 罐 塔 罐 消泡剂 消 持 连 维
水
消
23
24
连消步骤
培养基在配制罐中预热 预热到60-70℃ 预热 连消泵连续打入加热设备内 打入加热设备内，要求在20-30s 或更短的时间 打入加热设备内 内将培养基加热到130-140℃ 进入维持设备，保温一定时间。 进入维持设备 进入冷却设备，冷却至发酵温度 进入冷却设备 要计算的常有：蒸汽用量、维持时间、维持管长或维持罐 容积、连消塔参数
计算用蒸汽直接通入加热时， 度升温至90 作业 4.1 计算用蒸汽直接通入加热时，从25度升温至 度升温至 度的蒸汽耗量、 度升温到121度时的蒸汽耗量、从25度 度时的蒸汽耗量、 度的蒸汽耗量、从90度升温到 度升温到 度时的蒸汽耗量 度 升温到121度时的蒸汽耗量。 度时的蒸汽耗量。 升温到 度时的蒸汽耗量
第二章
培养基制备
液体培养基的灭菌
第三节
1
一
概述
发酵过程中灭菌的方法： 化学物质灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、 辐射灭菌、过滤介质除菌
石炭酸 （苯酚 ）： 来苏尔： 2%~5%，器械、环境的喷雾消毒 2%，皮肤消毒
新洁尔灭 （苯扎溴铵 ）：0.25%，无菌室喷雾消毒，皮肤器械表面消毒 甲醛： 漂白粉： 气体挥发杀菌，处理 染菌罐 染菌罐、厂房定期消毒 10%，环境、车间下水道、地沟等污染源消毒
开动搅拌时
9
1、升温阶段的加热时间 直接加热的加热时间计算
先算出 直接加热的蒸汽用量，再按 蒸汽在管道中的线速度（~25 m/s），计算多长时间 这些蒸汽能通完
τ=
S ⋅V F ⋅ϖ
τ : 直接加热时间，秒
S：直接加热蒸汽用量，公斤 V：蒸汽相应压力下的比体积，立方米 / 公斤 F：进蒸汽管道的截面积，平方米（多管道面积相加）
τ ——灭菌时间（秒）
k——反应速度常数，与菌的种类和加热温度有关（秒－１） N0——灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个/毫升） Ns——经过灭菌时间τ后，残存活菌个数（个/毫升）
12
3. 保温灭菌时间
例 3 有一发酵罐，内装培 养基 40 立方米，在 121℃下实罐灭菌，设每毫 升 2. 培养基中含有耐热的芽 孢 2 × 10 7 个，在121℃时的灭菌速度常数为 0.0287 秒 −1， 试求灭菌失败的几率为 0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。
实罐灭菌的有关计算
蒸汽用量 灭菌时间 冷却水量 冷却时间
7
实罐灭菌计算
灭菌升温 分两个时期 蒸汽间接加热 间接加热到70-95℃左右，再直接加热至 再直接加热至121 ℃ 间接加热 再直接加热至 工厂设计时，对升温阶段，主要计算： 间接、直接加热阶段的 加热所需时间 间接、直接加热阶段的 蒸汽耗量（二者公式相同，结果 相加即是升温时的蒸汽总耗量）
25
例 6 将例 2.4的间歇灭菌过程改为连 消： 2. 有一发酵罐，内装培养 基 40立方米，设每毫升培养 基中含有耐热的芽孢 2 × 10 7 个， 连续灭菌的温度为 131℃，此时的灭菌速度常 数为0.25 秒 −1，试求灭菌失败的 几率为0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。
2 为25℃，用 2公斤 /厘米（表压）的蒸汽经蛇管 间接加热至 90℃，取 K＝400 千卡 /米 2 ⋅ 小时 ⋅ ℃，
C ＝1千卡 /公斤 ⋅ ℃，求此升温阶段的加 热时间及蒸汽用量？ 若用10℃的冷却水，将培养基 从120℃降到 30℃，已知发酵液 t 1 = 80℃时，冷却水出口温度 t 2 = 30℃，求灭菌的降温过程 中的冷却水用量，及冷 却时间。
但小罐（ 以下）实际生产中不考虑， 但小罐（ 40m3以下）实际生产中不考虑，保险一些 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失， 大罐的升温时间长，为减少培养基营养损失，应考虑此影响 计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书） （计算方法有兴趣的同学可参考陈国豪的生物工程设备一书）
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4 保温阶段的蒸汽耗量 在保温阶段，活蒸汽仍不断通入发酵罐，由发酵罐顶若 干出口排出 此段蒸汽耗量可估算为： 直接加热的蒸汽耗量的30直接加热的蒸汽耗量的30-50% 30 40m3以上的罐，取30%， 40m3以下的罐，取50% 如，一个10m3的罐，升温时直接加热用蒸汽1.6吨， 则保温时用约0.5-0.8吨。
空罐灭菌的蒸汽耗量 S (Kg) 有如下的估算：
S = V F × ρ S × 5倍左右 VF
:发酵罐的全容积 全容积，m3 全容积 :灭菌罐压下蒸汽的密度，kg/m3
ρS
5
（二）实罐灭菌（间歇灭菌）
操作： 进料完毕，开搅拌 开搅拌以防料液沉淀 开搅拌 开夹套蒸气阀，使料液预热升温至70-95℃,关搅拌 关搅拌 关闭夹套蒸气阀门，开空气、出料、取样三个阀门进 蒸气，开排汽阀，包括小辫子（进料管、补料管、接种 管）和排汽管。 升温至121 ℃，保温30min（实际上要计算确定） 保温结束，关过滤器排气阀、进汽阀，关夹套下水道 阀，开冷却水进水阀。 待罐压低于过滤器压力时，通入无菌空气，开搅拌 开搅拌， 开搅拌 降温至培养温度。
λ，加热蒸汽的热焓，千卡/公斤 是查表得的蒸汽供应温度 t1 下的热焓 t 3，蒸汽冷凝后的液体温度 直接加热时，为培养基的终温t2f，
间接加热时，为加热蒸汽的温度t1，此时分母值 即为温度为t1时水的汽化潜热
11
3. 保温灭菌时间 复习： 蒸汽湿热灭菌 理论灭菌时间
N0 1 τ= 2.303 log k Ns
17
2.冷却阶段计算 已知t 1s = 120℃，t 1f = 30℃，t 2s = 10℃，取C1＝C 2＝1千卡/公斤， 发酵液t 1 = 80℃时，冷却水出口温度t 2 = 30℃，则有： Β=e
KA WC 2
=
t 1 - t 2s 80 − 10 ＝ ＝1.4 t 1 - t 2 80 − 30
KA 400 × 30 故上式中的W可算出为：W = = = 35664公斤/小时＝35.66吨/小时 ln1.4 lnB 则冷却时间为： G ⋅ C1 τ＝ W ⋅ C2 Β t 1s - t 2s 28000 1.4 120 - 10 ＝ = 4.68小时 ln ln Β - 1 t 1f - t 2s 35664 0.4 30 - 10
解： N 0 = 40 × 10 6 × 2 × 10 7 = 8 × 1014 个 N s = 0.001个 N0 2.303 2.303 τ＝ log = log 8 × 1017 = 1436秒＝23.9分钟 K N s 0.0287
(
)
13
在实际灭菌中，在升温阶段就有部分杂菌被杀死，特别 是加热到100℃以后，此作用更明显，因此所需保温灭菌 时间比计算结果要小。 一般认为，灭菌时间可减少10%左右
18
（三）培养基连续灭菌流程
培养基连续灭菌的优点 高温瞬时灭菌，物料受热时间短，营养成分破坏少； 总的灭菌时间较实罐灭菌大为减少 蒸汽负荷均衡，可避免用气高峰，锅炉利用率高。
19
20
培养基连续灭菌的缺点
涉及设备多，能耗大 对总蒸汽压力要求高 操作繁杂 物料焦化结垢经常发生，要时常检查清理 培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少 时适用
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5 实罐灭菌的冷却阶段的计算
此冷却过程属不稳定传 热，不像发酵阶段冷却 时，培养基温度不变， 此处 培养基温度也是渐降的 。 下式可用来计算冷却水 用量，或冷却时间
K，平均传热系数，千卡/平方米/小时/℃
KA
Β=e
WC 2
t 1 - t 2s = t1 - t 2
A, 传热面积，平方米 其中：
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（三）培养基连续灭菌流程 系统：加热 加热（连消塔/喷射加热器）、维持 维持（维持 加热 维持 罐/维持管）与冷却 冷却（喷淋/薄板换热）三部分 冷却
与淀粉质原料的糖化流程的功能分工很像
操作过程：
先用蒸汽对整个工艺流程中的有关设备进行消毒，然后， 将底物或培养基连续通过设备进行消毒
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（三）培养基连续灭菌流程
已知，查表得加热蒸汽温度t 1＝132.9℃，t 2s = 25℃，t 2f ＝90℃，
τ=
G ⋅ C t 1 - t 2s 28000 132.9 − 25 = 2.15小时 ln ＝ ln K ⋅ A t 1 - t 2f 400 × 30 132.9 − 90
蒸汽用量计算，取Q' 为加热量的5%，温度132.9℃时的蒸汽汽化潜热为 G ⋅ C(t 2f - t 2s ) + Q' 28000 ⋅ (90 − 25) S= ＝1.05 × ＝3688.5公斤＝3.69吨 518.1 λ - t3 518.1千卡/公斤（ = λ − t 3） ，则有
注意！ 注意！此公式中的温度符号与前加热 阶段的符号有重复，但意义不同的！ 阶段的符号有重复，但意义不同的！
t 1，培养基冷却过程中的 任一温度 t 2，培养基温度为 t 1时的冷却水的相应出口 温度。
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例2.5 有一装量为 28 m 3的发酵罐，蛇管面积为 30 m 2，现进行实罐灭菌，培 养基原始温度
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二
灭菌的实际操作
（一）空罐灭菌 也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是补料罐、消泡 罐，当物料未进罐前对罐进行的预先灭菌 空罐罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长 空罐罐灭菌要求温度较高， 通常空罐灭菌大都控制在 127-133 ℃（压力 0.150.2MPa），灭菌时间 30 -60 min。
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空罐灭菌的蒸汽耗量
解： 1.升温阶段计算
4.2 若在 若在121度的保温阶段蒸汽耗量为 吨，不计 度的保温阶段蒸汽耗量为2.0吨 度ห้องสมุดไป่ตู้保温阶段蒸汽耗量为 热损失，则保温时产生的二次蒸汽（121度）有多少？ （已 热损失，则保温时产生的二次蒸汽（ 度 有多少？ 度时蒸汽的焓为650千卡 公斤，121度蒸汽的焓为 千卡/公斤 知132.9度时蒸汽的焓为 度时蒸汽的焓为 千卡 公斤， 度蒸汽的焓为 647千卡 公斤） 千卡/公斤 千卡 公斤）
去发酵 糖液 料 液 罐 塔 罐 消泡剂 消 持 连 维
水
消
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连消步骤
培养基在配制罐中预热 预热到60-70℃ 预热 连消泵连续打入加热设备内 打入加热设备内，要求在20-30s 或更短的时间 打入加热设备内 内将培养基加热到130-140℃ 进入维持设备，保温一定时间。 进入维持设备 进入冷却设备，冷却至发酵温度 进入冷却设备 要计算的常有：蒸汽用量、维持时间、维持管长或维持罐 容积、连消塔参数
计算用蒸汽直接通入加热时， 度升温至90 作业 4.1 计算用蒸汽直接通入加热时，从25度升温至 度升温至 度的蒸汽耗量、 度升温到121度时的蒸汽耗量、从25度 度时的蒸汽耗量、 度的蒸汽耗量、从90度升温到 度升温到 度时的蒸汽耗量 度 升温到121度时的蒸汽耗量。 度时的蒸汽耗量。 升温到 度时的蒸汽耗量
第二章
培养基制备
液体培养基的灭菌
第三节
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一
概述
发酵过程中灭菌的方法： 化学物质灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、 辐射灭菌、过滤介质除菌
石炭酸 （苯酚 ）： 来苏尔： 2%~5%，器械、环境的喷雾消毒 2%，皮肤消毒
新洁尔灭 （苯扎溴铵 ）：0.25%，无菌室喷雾消毒，皮肤器械表面消毒 甲醛： 漂白粉： 气体挥发杀菌，处理 染菌罐 染菌罐、厂房定期消毒 10%，环境、车间下水道、地沟等污染源消毒
开动搅拌时
9
1、升温阶段的加热时间 直接加热的加热时间计算
先算出 直接加热的蒸汽用量，再按 蒸汽在管道中的线速度（~25 m/s），计算多长时间 这些蒸汽能通完
τ=
S ⋅V F ⋅ϖ
τ : 直接加热时间，秒
S：直接加热蒸汽用量，公斤 V：蒸汽相应压力下的比体积，立方米 / 公斤 F：进蒸汽管道的截面积，平方米（多管道面积相加）
τ ——灭菌时间（秒）
k——反应速度常数，与菌的种类和加热温度有关（秒－１） N0——灭菌开始时，污染的培养基中杂菌个数（个/毫升） Ns——经过灭菌时间τ后，残存活菌个数（个/毫升）
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3. 保温灭菌时间
例 3 有一发酵罐，内装培 养基 40 立方米，在 121℃下实罐灭菌，设每毫 升 2. 培养基中含有耐热的芽 孢 2 × 10 7 个，在121℃时的灭菌速度常数为 0.0287 秒 −1， 试求灭菌失败的几率为 0.001 （即灭菌后残留的芽孢 数为0.001个）所需的时间。