第二章_培养基灭菌1剖析
纯培养技术和显微技术重点与难点剖析纯培养技术1
第二章：纯培养技术和显微技术重点与难点剖析一、纯培养技术1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。
获得纯培养物涉及的相关技术包括：无菌技术、微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。
2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。
重点在实验课中掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。
3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。
自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体-即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。
固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：（1）划线平板法将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。
（2）倾注平板法和涂布平板法这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55°C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。
稀释倾注平板法操作较麻烦。
在进行微生物分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。
实验二.培养基的配制及灭菌
实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。
4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。
二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。
培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。
为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。
基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。
在配制母液时应注意防止沉淀产生。
绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。
各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。
通常使用的浓度单位是mg/L。
配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。
灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。
培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。
培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。
灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。
（一）、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。
生化工程第二章-培养基灭菌(1)
培
养
基
灭
菌
生
化 工
N0 40 10 6 2 105 81012
程 N 10 3; K 1.8 min 1
第
二 章
t 2.303 lg N0
KN
培 养
2.303 lg(81015 ) 20.34 min
基
1.8
灭
菌
生 化 工 实际上，培养基在加热升温时(即升温阶 程 段)就有部分菌被杀灭，特别是当培养基 第 加热至 100 ℃ 以上，这个作用较为显著。 二 因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的 章 时间要短。严格地讲，在降温阶段也有杀
基 灭
灭菌的依据。
菌
生
化 工
微生物热死灭动力学方程
程 微生物热致死是指微生物受热失活直到
第 死亡,微生物受热死亡主要是由于微生物
二 章 培 养 基
细胞内酶蛋白受热凝固,丧失活力所致。
在一定温度下,微生物受热后,其死活细胞 个数的变化如化学反应的浓度变化一样, 遵循单分子反应速率理论。
灭
菌
生
化
工 程 第 二 章
章 表明：ln K 与 1/T 之间呈直线关系，其斜率
培 为 –ΔE/R，在不同 T 时做灭菌试验，求得
养 相应的 K 值，即可求出ΔE。 基
灭
菌
生 化 工 程
第 二 章
培 养 基 灭 菌
生 化 工 以上可以看出：ΔE 同 T 一起决定 K 值，即： 程
第 二
K KE,T
章 培 养
将ln K E ln A两边对T求导 RT
基 灭
d ln K dT E RT 2
菌
生
培养基的灭菌
焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%
煤酚皂（来苏 1%-5% 尔）
2. 辐射灭菌
原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸 的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和γ射线。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。
3．干热灭菌法
原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变 性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180℃ 1-2小时。 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌
二. 培养基灭菌温度的选择
选择即能达到灭菌要求， 又保证营养成分不被破坏的温度。
三 ．影响灭菌效果的因素
微生物种类：不同的微生物k值不同。 初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初 始菌量N0的对数成正比。 培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热 性。 传热与混合状况：影响受热均匀度。 培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。 蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。 pH：酸性pH下可加快微生物热死速率 。
四、高温对培养基成分的有害影响及其防止
消除高温有害影响的措施
(1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法） （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先 将糖液与其他成分分别灭菌后再合并； （3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作 分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉 淀； (4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如 含糖组合培养基）可进行低压灭菌。
6．火焰灭菌法
原理：利用火焰直接杀死微生物。
使用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口
二. 湿热灭菌原理
1.微生物热死动力学（对数残存定律） - dN / dt =K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（S） k：反应速度常数（S-1） dN / dt: 菌体受热死亡速率
培养基的灭菌
一、常用培养基配置及灭菌一、实验目的1．了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；2．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。
3．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。
培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
1、热力灭菌：利用高温使菌体蛋白质变性或凝固，代谢发生障碍，导致细菌死亡。
包括：（1）焚烧法：用火焚烧，是很彻底的灭菌方法，适用于废弃的污染物品和有传染性的动物尸体等。
（2）烧灼法：直接再火焰上烧灼，用于接种环(针)和试管口或瓶口的灭菌。
（3）干烤法：在干烤箱通电后利用高热空气进行灭菌。
一般加热160-170℃，维持2小时即可杀灭包括芽胞在内的一切微生物。
主要用于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器等。
（4）煮沸法：煮沸100℃5分钟可杀死细菌的繁殖体，一般消毒以煮沸10分钟为宜。
如需要杀死芽胞则要煮沸1-3小时。
主要用于一般外科器械、注射器、胶管和食具等的消毒。
（5）间歇灭菌法：是利用反复多次的流通蒸汽，杀死细菌所有繁殖体和芽胞的一种灭菌法。
本法适用于耐热物品，也适用于不耐热(<100℃)的一些物质如某些培养基的灭菌。
具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺氏流通蒸汽灭菌器内，100℃加热15-30分钟杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置37℃温箱中过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有繁殖体和芽胞全部杀死。
若有某些物品不耐100℃，则可将温度降至75-80℃，每次加热的时间延长至30-60分钟，次数增至3次以上，也可达到灭菌目的，如用血清凝固器对血清培养基或卵黄培养基的灭菌。
生物反应工程 培养基的制备与灭菌
三、加热灭菌的原理
1.、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力； 致死温度、致死时间 2、微生物的热致死动力学：对数残留定律
一级反应： 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡 率），与N呈线性关系，即：
dN − = K⋅N dθ 式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比
热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加 热温度有关，需通过实验才能测定。
1）、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中， 能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物 分子中去，而其自身的结构没有多大的变化， 但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20u/mL增加 到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分 子中，从而提高了青霉素G的产量。
积分边界条件：N0→Nθ；t0=0
∫
Nθ
N0
θ dN N − = − K ∫ dθ ⇒ ln = − K ⋅ θ ⇒ Nθ = N 0 ⋅ e − K ⋅θ 0 N N0
Nθ N0 N0 1 ln = − K ⋅ θ ⇒ ln = K ⋅ θ ⇒ θ = ⋅ ln N0 Nθ K Nθ
式中，θ 灭菌时间（s）； N0 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）； Nθ 经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。
3、影响酸水解的因素 酸的种类 主要因素 浓度（酸的浓度、淀粉的浓度） 水解温度
（二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素 复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成 的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通 过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚 糖。
影响复合反应的因素： 1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）： DE值＝还原糖/干物质×100％ 2.、酸的影响：
1培养基灭菌和空气除菌技术
工业上实际使用的蒸汽灭菌方法有 两种：
(1)实罐灭菌（即分批灭菌） 将配制好的培养基放入发酵罐，连同发酵罐进行灭菌。开 始时蒸汽先通过夹套或蛇管间接加热，以免过多的冷凝水 稀释培养基。待罐温达80～90℃时，可直接将蒸汽通入 培养基直至到达灭菌温度（一般为121℃，即表压为 0.1MPa）后，维持此温度20～30分钟。此时有关排汽 阀门仍应适当开启，以使蒸汽流动通畅，并同时对附属管 道灭菌。灭菌完毕后，应及时通入无菌空气使罐内维持正 压，然后通过夹套或蛇管将培养基尽快冷却。
热灭菌法，因其中有血清、氨基酸等易受
热破坏的成分。这种培养基应采用孔径小
于0.2微米的滤膜来除菌。
2. 空气的除菌技术
在生物生产过程中，特别是在好气发酵过程和进行
无菌操作的工作室中，都需要使用大量无菌空气。
工业上大规模的无菌空气是用过滤方法获得的。用 于空气除菌的过滤器有两大类，即早期采用的深层 过滤法和后来发展起来的绝对过滤法。
全和合理的。
扩散作用是指小于1微米的颗粒所产生的布朗运动而形成的扩散，当 颗粒遇到介质后被去除。 静电作用是指当颗粒与介质间具有不同电荷时的静电吸引作用，细菌 表面常带负电荷。 介质除菌是上述四种作用的综合作用，也可说总除菌效率是这四种除 菌效率之和。
在以上四种除菌作用中，惯性和拦截作用
随气流速度增大而加强，而扩散和静电作
由于微孔很易被堵塞，因此在微孔膜的外
表应用孔径较大的过滤材料覆盖，并串联
前过滤器，以免空气中的较大颗粒尘埃或
夹带的铁锈等杂物对微孔的损害。使用一
段时间后，可反吹再生，以延长使用寿命。
第二章_培养基灭菌1
不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A e 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
例：
嗜热脂肪芽胞杆菌孢子 和 维 生 素 B1 的 热 处 理 数 据 （一定 T 下， ln(N/N0 ) = - K t ），就不同的 T，求 得前者的比热死亡速率常数 KBS 和后者的比破坏速率常 数 KVB， 按 lnK——1/T 标 会 ， 得图，由图算出： • △EBS=67000×4.184 J/mol • △EVB=22000×4.184 J/mol • ln K = - △E /RT + ln A
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度 T 对 K 的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度 和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A e
E / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol· K T：绝对温度
进行培养基灭菌的操作方式 • 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌
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C：对热不稳定物质的浓度
Kd :热不稳定物质的分解速率常数s-1。
分解速率常数Kd随物质种类和温度而 不同（营养物质中维生素最容易被破坏， Kd最大），温度对Kd 的影响也遵循阿伦 尼乌斯方程：
Kd A'eE'/ RT
A′：系数； R：气体常数；T：绝对温度 △E′：不稳定物质热分解反应的活化能。
上式取对数得：ln K = - △E /RT + ln A
不同种的微生物的热死 灭反应的△E各不相同， 对于某种微生物，在一 定的T下作灭菌实验， 求得相应的K值 ，按lnK——1/T作图， 从直线的斜率可求出△E。
微生物的热死灭动力学
（2）K、△E、T三者之间的关系
K=f(△E、T) K A eE / RT
对液体培养基的湿热灭菌是指：将培养基中杂菌总 数N0杀灭到可以接受的总数N，至于所需的温度和 时间，决定于
• 杂菌孢子的热死灭动力学 • 培养基中有效成分受热破坏的可接受程度 • 反应器的形式和操作方法
• 微生物的热死灭动力学（对数残留定律）
对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物 受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存 的微生物数量成正比。
无菌状态: 从系统中杀死或者清除所有活 的微生物和他们的孢子.
培养基的灭菌：杀灭或者除去培养基中有 生活能力的细菌营养体及其孢子。杀灭比 除去杂菌更加常用。
灭菌:是指用物理或化学方法杀灭物料或设 备中的一切生命物质的过程。
常见的灭菌和消毒的物理方法
常用控菌的化学方法
常用的灭菌方法 :
• 湿热灭菌Steam Sterilization (121℃,2030min）
杂菌
营养物质
dN k N dt
dc Kdபைடு நூலகம் c dt
ln(N/N0 ) = -K t ln(C/C0 ) = -Kd t
K A eE / RT Kd A'eE'/ RT
△T
△K
△ Kd
K对T的变化率是怎么样的？
K A eE / RT
从上式可以做如下几点分析： （1）△E值可求
第二章 培养基灭菌
• 微生物的培养过程： 培养基配制→灭菌→接种→培养
• 为什么要进行培养基灭菌？
• 1) 生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而 损失，造成生产能力的下降。
• 2) 由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了 发酵液的某些理化性质，使目标产物的提 取困难，造成收得率降低或使产品质量下 降。
微生物的热死灭动力学
在对培养基进行热灭菌时，在杂菌死亡的同时， 培养基中一些不太稳定的成分也会因受热而破坏， 例如：糖溶液会焦化，蛋白质会变性，维生素失 去活性，醛糖与氨基化合物反应——美拉德反应， 一些化合物会发生水解。
营养物质的受热破坏也可以看作一级反应：
dc Kd c dt
ln(C/C0 ) = -Kd t
• 3) 污染的杂菌可能会分解产物，而使生产 失效。
• 4) 发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解， 而使生产失效。
需要无菌的单元和措施:
• 1)培养基和设备需经灭菌 • 2)好氧培养过程中使用的空气应经除菌
处理 • 3)设备应严密，生物反应器中要维持高
于环境压力 • 4) 使用无污染的纯粹种子 • 5)培养过程中加入的物料也要经过灭菌
• 即使同一种微生物，其营养细胞和 芽胞的K值也有很大的差别，营养细 胞易于受热死亡，K值很高。120℃灭 菌K值可大致为1010（min-1）数量级， 而细菌孢子的K值在120℃只有10数量 级，下表是典型微生物培养环境中各 种微生物对湿热灭菌的相对热阻。
微生物的热死灭动力学
热阻越大，越不易杀灭，K值小。对培养基进行 热灭菌，必须以细菌的孢子为杀灭对象。
ln N Kt No
N :存活率,无菌程度；t：灭菌时间 No
N
• 将存活率 No 与灭菌时间t在半对数坐 标纸上标绘可以得到直线。直线斜率K。
K值越大表示微 生物越容易死亡
ln N Kt No
K（比热死亡速率常数）由两个因素决定 1、灭菌温度 2、微生物的种类和存在方式
在一定温度下，比热死亡速率常数K随微 生物种类不同而不同。例如，在121℃， 枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.047～0.063s-1； 梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03 s-1； 嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013 s-1。
微生物的热死灭动力学
K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更 重要的是温度T对K的影响，这是热灭菌工程设计 中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？）
K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度
和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：
K A eE / RT
式中 A：频率因子，min-1 △E：菌体死灭反应活化能，J/mol R：气体常数 8.28J/mol·K T：绝对温度
一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么：
温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题）
从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大
灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养
的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。
求一个变量（K）对另一个变量（T）的变化率 是 导数问题。
对ln K = - △E /RT + ln A 两边求T的导数
d (ln K ) E
dN k N dt
均相系统，它 符合化学反应 的一级反应动 力学。
N：培养基中任一时刻的活微生物浓度（个/L） t：灭菌时间min K：比热死亡速率常数min-1
dN k N dt
上式适合于灭菌过程的任意时刻。 为了对灭菌全过程进行考虑，上式作
变上限积分，取边界条件t0=0 N=N0 积分式：
• 干热灭菌Dry heat sterilization （160℃保 温1～2h,玻璃器皿等）
• 化学除菌 • 过滤除菌Filtration(澄清流体的除菌,air ) • 射线灭菌Irradiation （紫外线穿透力低，仅
用于表面消毒和空气的消毒）
进行培养基灭菌的操作方式
• 分批（间歇）灭菌 • 连续灭菌