重组蛋白质药物纯化工艺验证PPT
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蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
持膜內外電位差平衡h移在冰浴中加入烘乾並磨碎的ammoniumsulfate至飽和度為60取50ml待Байду номын сангаас化之蛋白質攪拌15分鐘後以9000xg離心15min取出沉澱物並標示鹽析濃度上清液重複上述步驟作ammoniumsulfate至飽和度100分別取出其沉澱物準備透析沉澱物以buffer溶解將溶液置于透析管中在001mph7的phosphatebuffer中進行4透析隔夜
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
为什么要 • HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6万~8万 r/min。可用来测定蛋白质分子 量。
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
4
蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性
• 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料， 研究其结构与功能；
• 其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单 一的蛋白质作为原材料；
• 最后，为了生产性能更优良的蛋白质， 需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯 化，从而开发出相关产品。
5
本章概要
• 蛋白质纯化方法 • 蛋白质纯化原则 • 纯化步骤 • 蛋白质的鉴定
12
超滤法 应用正压或离心力 使蛋白质溶液透过 有一定截留分子量 的超滤膜，达到浓 缩蛋白质溶液的目 的。
13
凝胶过滤
是按照天然蛋白质相对分子质 量大小进行分离的技术，又称为 分子筛层析或排阻层析。
14
15
• 超速离心
离心（centrifugation）：利用机械的快速 旋转所产生的离心力，将不同密度的物 质分离开来的方法。
• ③温度 0~4℃
35
3、蛋白质的粗分级（粗提）
• 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后， 蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低， 采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩， 同时去除大量的杂质。
• 常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶 剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、 超滤…
36
4、蛋白质的细分级
45
•分子筛层析
Gel filtration chromatography
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
4
蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性
• 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料， 研究其结构与功能；
• 其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单 一的蛋白质作为原材料；
• 最后，为了生产性能更优良的蛋白质， 需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯 化，从而开发出相关产品。
5
本章概要
• 蛋白质纯化方法 • 蛋白质纯化原则 • 纯化步骤 • 蛋白质的鉴定
12
超滤法 应用正压或离心力 使蛋白质溶液透过 有一定截留分子量 的超滤膜，达到浓 缩蛋白质溶液的目 的。
13
凝胶过滤
是按照天然蛋白质相对分子质 量大小进行分离的技术，又称为 分子筛层析或排阻层析。
14
15
• 超速离心
离心（centrifugation）：利用机械的快速 旋转所产生的离心力，将不同密度的物 质分离开来的方法。
• ③温度 0~4℃
35
3、蛋白质的粗分级（粗提）
• 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后， 蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低， 采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩， 同时去除大量的杂质。
• 常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶 剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、 超滤…
36
4、蛋白质的细分级
45
•分子筛层析
Gel filtration chromatography
蛋白质药物生产工艺验证
相关定义
• Operational Parameter:操作参数
– Critical Operational Parameter: 关键操作参数 – 要求控制在特定的、较窄的操作范围以保证产品的质 量符合标准（说明书）。Critical Process Parameter (“CPP”) – Non-Critical Operational Parameter: 非关键操作参 数 – 超出关键操作参数定义范围的所有工艺参数。非关键 操作参数可分为主要工艺参数和非主要工艺参数。
相关定义
• Parameters: 参数 • Operational Parameter: 操作参数 • 一个输入变量或制造工艺的某种条件，可以在工艺过程中 直接被控制。典型地，物理或化学参数（温度，处理时间、 流速、冲洗体积、试剂浓度、缓冲液pH）
– Critical Operational Parameter: 关键操作参数 – Non-Critical Operational Parameter: 非关键操作参数
蛋白药物生产工艺验证
王春艳 20-MAR-2013
工艺验证
• 工艺验证应当证明一个生产工艺按照规定的工艺参数能够 持续生产出符合预定用途和注册要求的产品。（中国2010 版GMP） • 收集并评估从工艺设计阶段一直到商业化生产的数据，用 这些数据确立科学证据，证明该工艺能够始终如一的生产 出优质产品。（FDA2011工艺验证指南） • 书面话的证据。证明工艺在所建立的参数范围内能有效和 重复生产出符合预期标准和质量属性的医药产品。 （EU2001GMP） • 记录在案的证据，证明工艺流程在确定的参数范围内运行， 按照预先确定的规范和质量标准，可有效地、重复地生产 中间体或原料药。（蛋白质生产的工艺验证）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!
各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析 所需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的 中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
基因工程重组蛋白的分离纯化放映课件
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
8
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
1
仍 有 很 大 差 距 。
质 纯 化 处 理 与 先 进
国 家
相 比
，
但 “ 下 游 ” 技 术 ，
尤 其
是 蛋
白
“ 上 游 ” 已 与 国 外
差 距
缩 小
，
过 多 年 的 努 力 ， 我 国 基 因 工 程
• 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
点对比
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
3
一．获得基因工程产品的特点
⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物 的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代 谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物 等对目的产物的分离影响很大。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
8
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。
基因工程重组蛋白的分离纯化
生物工程下游技术 第七组 马夕尧
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
1
仍 有 很 大 差 距 。
质 纯 化 处 理 与 先 进
国 家
相 比
，
但 “ 下 游 ” 技 术 ，
尤 其
是 蛋
白
“ 上 游 ” 已 与 国 外
差 距
缩 小
，
过 多 年 的 努 力 ， 我 国 基 因 工 程
• 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击 法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用 的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内 切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母 作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学 组成选择合适的酶.并确定相应的使用次序，控制好温度、pH值和 酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂(苯、甲苯)等可以改变细胞壁 或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。
点对比
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
3
一．获得基因工程产品的特点
⑴ 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物 的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代 谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物 等对目的产物的分离影响很大。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
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重组蛋白质药物纯化工艺验证PPT
Slide 1：引言
-介绍重组蛋白质药物的背景和重要性
-引出纯化工艺验证在新药开发中的作用
Slide 2：重组蛋白质药物的制备
-简要介绍重组蛋白质药物的制备过程，包括蛋白表达和纯化步骤
Slide 3：纯化工艺验证的目的
-解释纯化工艺验证的目的是确保药物纯度和质量
-着重介绍纯度和纯度分析的重要性
Slide 4：纯化工艺验证的步骤
-详细阐述纯化工艺验证的各个步骤，包括蛋白质纯化、纯度分析和
稳定性评估
Slide 5：蛋白质纯化
-介绍纯化工艺的第一步，包括采用何种方法进行蛋白质分离和纯化，如亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析等
Slide 6：纯度分析
-解释纯度分析的目的和方法，如SDS-、凝胶过滤层析、糖基化分析
等
-着重介绍高效液相色谱法（HPLC）在纯度分析中的应用
Slide 7：稳定性评估
-强调稳定性评估在纯化工艺验证中的重要性
-介绍稳定性评估的方法，包括温度稳定性、酸碱稳定性和氧化稳定性等
Slide 8：纯度规格
-解释纯度规格的定义和意义
-强调纯度规格与纯化工艺验证的关系
-介绍纯度规格的制定原则和方法
Slide 9：纯化工艺验证数据分析和解释
-提及纯化工艺验证数据的重要性
-强调数据分析和解释在确定最佳纯化工艺的作用
Slide 10：结论
-总结纯化工艺验证的重要性和目的
-强调纯化工艺验证对药物质量的重要影响
Slide 11：问题与讨论
-提出相关问题，引发讨论和思考
-鼓励参会者提问和分享观点
以上为针对重组蛋白质药物纯化工艺验证的PPT内容建议，可根据自己的实际情况进行相应的修改和调整。
同时，建议在每一张幻灯片上加入适当的图片和图表，以提高内容的可视化和直观性。