抗原亲和纯化
抗原抗体的纯化
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（二）离心时间
依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。
• 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从 离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时 间； • 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间， 即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指 颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。
但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰 蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。
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（三） 影响盐析的因素
• 1. 蛋白质的浓度
过高过低都不好，一般认为2.5 %~3.0%蛋白质浓度比较 合适。
• 2. pH
蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液pH 常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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三、影响因素
离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 • 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如 5000r/min等。 • 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示， 如60000×g等。 • 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。 即：
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（三） 影响有机溶剂沉淀的因素
• 1. pH ：一般是欲分离物的pI（等电点）。 • 2. 温度：实验要求在低温条件下操作，有机溶剂需预冷
至较低温度。
• 3. 样品浓度：过高过低均不好，0.5 % ~ 2 % • 4. 有机溶剂的浓度：有机溶剂的用量一般为溶液体积
抗原制备的原理
抗原制备的原理引言：抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，是免疫系统识别外来物质的关键因素之一。
在生物医学研究和临床应用中，制备高纯度的抗原对于开展免疫学研究、疫苗研发和诊断试剂的制备具有重要意义。
本文将介绍几种常见的抗原制备方法及其原理。
一、蛋白质抗原制备蛋白质是常见的抗原类型，其制备一般分为两种方式：天然蛋白质提取和重组蛋白质表达。
1. 天然蛋白质提取天然蛋白质是从生物体中提取的，如细胞、组织、血浆等。
提取过程中需要注意保持蛋白质的完整性和活性。
一般的提取步骤包括样品收集、细胞破碎、离心分离等。
常用的提取缓冲液包括PBS、RIPA缓冲液等，可添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以防止蛋白质降解。
提取得到的天然蛋白质可以直接应用于免疫学研究或进行纯化。
2. 重组蛋白质表达重组蛋白质是通过基因工程技术在表达系统中合成的蛋白质。
常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
制备重组蛋白质的关键是选择合适的表达载体和宿主细胞，并通过诱导表达、细胞破碎和纯化等步骤得到目标蛋白质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
二、多肽抗原制备多肽抗原是由氨基酸组成的短链蛋白质。
多肽抗原的制备一般采用化学合成或基因工程方法。
1. 化学合成化学合成是利用合成肽技术合成多肽抗原。
合成肽的方法有固相合成和液相合成两种。
固相合成是将氨基酸逐个加到树脂上的方法，通过化学反应逐步合成多肽链。
液相合成则是在溶液中逐步合成多肽链。
化学合成的优势在于可以合成多肽序列的任意组合，但对于较长的多肽链合成较为困难。
2. 基因工程基因工程是通过合成基因序列，将其导入表达系统中合成多肽抗原。
基因工程制备多肽抗原的关键是选择合适的表达载体和宿主细胞，并通过诱导表达、细胞破碎和纯化等步骤得到目标多肽。
在基因工程中，可以通过突变、插入或删除等操作来调整多肽的序列。
三、糖类抗原制备糖类抗原是由糖基组成的多糖或糖蛋白复合物。
由于糖类结构复杂，其制备较为困难，常用的方法包括化学合成和提取纯化。
第八章亲和纯化
加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。 • 但是，脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂，
高浓度下容易引起蛋白质的失活或变性。
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• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加
剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
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• 蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与 整个蛋白质分子相比要小得多，由于 不是整个分子或物质参与亲和结合， 亲和作用的分子(物质)对可以是：大 分子—小分子，大分子—大分子，大 分子—细胞，细胞—细胞。
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• 具有亲和作用的分子(物质)对之间具 有“钥匙”和“锁孔”的关系。
• 除此之外，还需要分子或原子水平的 各种相互作用才能完整地体现亲和结 合作用。这些相互作用包括以下几个 方面。
• 这种利用金属离子为配基的亲和层析一般称为 金属螯合层析(Metal chelate chromatography) 或固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。
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• 2.1.8 组氨酸
• 具有弱疏水性、咪唑环为弱电性,可与蛋白 质发生亲和结合作用。
• 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质组氨 酸 白质等电点的溶液中，固定化组氨酸 的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大， 亲和吸附作用降低。
• 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差 较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度 的梯度洗脱法。
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• 2.1.9 肝素 • 肝素(heparin)是存在于哺乳动物的肝、肺、
2.1离子强度
• 如果亲和结合作用主要源于静电引力，则 提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和 作用。
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
抗原分离纯化的基本操作方法
抗原分离纯化的基本操作方法抗原分离纯化是生物化学和生物技术领域中十分重要的研究方法，用于从混合物中分离出特定的抗原并进一步纯化。
下面将介绍抗原分离纯化的基本操作方法。
1. 抗原的提取：在分离纯化之前，首先需要从生物样品中提取目标抗原。
提取方法根据抗原的特性和来源可以有多种选择，如细胞裂解、超声波破碎、冷冻切片等。
2. 色谱层析：色谱层析是抗原分离纯化的重要手段之一。
根据抗原的特性和需求，可以采用多种类型的色谱层析技术，如离子交换层析、亲和色谱、凝胶过滤层析、逆流层析等。
色谱层析的原理是通过选择性结合、分离和洗脱，将混合物中的目标抗原与其他成分分离。
3. 过滤：过滤是常用的样品预处理和分离纯化步骤。
可以通过滤膜的孔径大小选择性地分离不同大小、不同形态的分子。
例如，通过滤膜可以分离大分子抗原和小分子杂质。
4. 盐析：盐析也是一种常用的分离和纯化方法。
盐析是通过改变样品中的离子强度和溶剂的pH值，使溶液中的蛋白质产生相互吸引力或排斥作用，从而实现蛋白质的分离和纯化。
可以通过逐渐增加或减少盐浓度的方法来控制蛋白质的溶解度。
5. 电泳：电泳是一种常用的分离纯化手段，可以根据抗原的电荷和分子大小进行分离。
电泳可分为凝胶电泳和毛细管电泳两种，其中凝胶电泳又分为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和凝胶过滤电泳等。
该方法可以通过电流作用下移动不同电荷的分子而实现分离纯化。
6. 超速离心：超速离心是利用离心力作用下分子的悬浮性差异进行分离纯化的方法。
通过调节离心速度和时间，可以将目标抗原与其他成分分离。
7. 透析：透析是将混合物置于半透膜中，利用溶质的扩散来实现溶质的分离和去除。
透析可以有效去除小分子的杂质，使溶液中的目标抗原纯化。
8. 离子交换：离子交换是根据溶液中离子的电荷进行分离纯化的方法。
通过调节溶液的pH值和盐浓度，可以控制目标抗原与离子交换树脂的吸附和解吸，实现分离纯化。
9. 亲和层析：亲和层析是利用抗原与特定亲和配体（如抗体、金属离子等）之间的特异结合来实现的纯化方法。
抗原的表达和纯化
目的蛋白与 GST fusion protein与beads的结合对pH值是相当敏 beads结合时， 感的pH>8.0对结合不利。一般binding buffer pH=7.4 pH值没调好
蛋白结合后过 度的洗涤 为避免将一些结合不牢固的目的蛋白洗下来，要 限制洗涤次数
GST亲和纯化中常见的问题2
目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 融合蛋白和6X HIS Tag融合蛋白。
融合蛋白的优点有： (1)表达效率高； (2) 产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免 细菌蛋白酶降解的最好措施； (3) 产生的蛋白质易于鉴定，纯化。 GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达 方便而且基 本不影响蛋白的活性
（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构
调控区
DNA
结构基因
I
P
O
Z
Y
A
调节基因
操纵序列
启动序列
Z： β-半乳糖苷酶 Y： 透性酶 A：乙酰基转移酶
CAP结合位点
（二）阻遏蛋白的负性调节
阻遏基因
DNA
I
pol P
O
Z
Y
A
mRNA
阻遏蛋白
没有乳糖存在时
启动转录
DNA
I
pol P
OБайду номын сангаас
Z
Y
6x His fusion protein的洗脱原理是通过高浓度的咪唑洗脱目 的蛋白，洗脱液中的咪唑通过和金属离子结合而高效地替换 掉His标签融合蛋白。 由于一些宿主细胞蛋白上也含有组氨酸，可以结合在beads 上，洗脱时也会被洗脱下来（特异性差的原因）。因此在洗 涤液中加入低浓度咪唑，可以避免宿主细胞蛋白的结合。
抗原亲和纯化
抗原亲和纯化抗原亲和纯化是一项分离和纯化特定蛋白质的方法，该方法利用特定抗体与其相应的抗原结合，并将蛋白质从复杂的混合物中分离出来。
在分子生物学和生物化学领域中，抗原亲和纯化是常用的技术之一，可用于纯化单一蛋白、获得活性蛋白、制备抗体等。
本文将详细介绍抗原亲和纯化的基本原理、技术流程、优缺点及其应用。
一、基本原理抗原亲和纯化的基本原理是利用特定抗体与其相应的抗原结合。
抗原可以是任何分子，包括蛋白质、多肽、小分子化合物等。
抗体是一类高度特异性的蛋白质，它可以识别并结合与其特异抗原相结合的部位。
一般来说，为了进行抗原亲和纯化，需要在动物体内注射抗原，使其产生特异的抗体。
分离和纯化抗体后，将其与待分离蛋白质混合，待其结合后再使用某些方法将其分离出来，得到纯化的蛋白质。
二、技术流程1. 抗原注射：在动物体内注射待纯化蛋白质的抗原，使其产生特异的抗体。
2. 收集血清：收集动物体内产生的血清，含有特异的抗体。
3. 分离抗体：使用某种技术，如离心沉淀、蛋白A或蛋白G纯化、亲和层析等，将抗体从复杂的混合物中纯化出来。
4. 准备抗原柱：使用某种固相材料如琼脂、硅胶、聚丙烯等，在其表面共价结合相应的抗原，制作成抗原柱。
5. 抗原柱层析：将待分离蛋白质加入到抗原柱中，使其与抗原结合，其他蛋白质被洗掉，得到纯化的蛋白质。
三、优缺点抗原亲和纯化具有许多优点，例如高效、高纯度、高特异性、全程在几个小时内完成等。
此外，该方法对样品来源不敏感，适用于多种来源的样品，包括细胞培养物、组织等。
在制备抗体时，其特异性和亲和力都比其他方法制备的抗体要高。
不过，抗原亲和纯化也存在一些缺点。
首先，制备特异抗体的过程耗时且费用较高。
其次，该方法不适用于无法制备到高质量抗体的蛋白质，如一些小分子等。
此外，抗体的亲和力和特异性有时会受到批次之间的变异，需要对纯化效果进行不断优化。
四、应用抗原亲和纯化具有广泛的应用。
在分子生物学中，该方法广泛用于制备纯化的蛋白质，例如酶、激素等。
抗原制备的实验报告
一、实验目的1. 掌握抗原的制备方法，了解不同类型抗原的制备和纯化技术；2. 熟悉常用佐剂的使用；3. 学习玻璃器材的清洁和消毒方法；4. 培养实验操作技能和实验数据处理能力。
二、实验原理抗原是指能够引起机体产生特异性免疫反应的物质。
在抗原制备实验中，我们需要从生物样品中提取目标抗原，然后对其进行纯化和处理，使其具有良好的免疫原性和特异性。
三、实验材料1. 生物样品：细菌、病毒、细胞、组织等；2. 试剂：细胞裂解剂、超声破碎剂、离心机、玻璃器材、消毒液、佐剂等；3. 仪器：显微镜、离心机、分光光度计、移液器、培养箱等。
四、实验步骤1. 样本处理（1）取适量生物样品，用无菌操作技术进行接种；（2）根据样品类型，选择合适的裂解方法，如细胞裂解、超声破碎等；（3）裂解后，将样品置于离心机中，以适当转速和时长进行离心，收集上清液。
2. 抗原提取（1）取上清液，加入适量的缓冲液和离心机，以适当转速和时长进行离心；（2）收集沉淀，加入适量的缓冲液，进行溶解；（3）重复离心，直至沉淀完全溶解。
3. 抗原纯化（1）根据抗原特性，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等；（2）将溶解的抗原加入纯化柱，进行洗脱和收集；（3）根据需要，可进行多次纯化，以提高抗原纯度。
4. 抗原处理（1）将纯化后的抗原加入适量的佐剂，进行免疫原性增强；（2）将抗原与佐剂混合均匀，备用。
5. 实验结果观察（1）通过观察显微镜下的细胞形态，了解抗原制备过程中的细胞状态；（2）通过分光光度计检测抗原浓度，了解抗原纯化效果；（3）通过实验数据分析，评价抗原制备的成功率。
五、实验结果与分析1. 样本处理过程中，细胞形态良好，无污染现象；2. 抗原提取过程中，上清液清晰，无沉淀；3. 抗原纯化过程中，纯化效果良好，抗原浓度达到预期；4. 抗原处理过程中，抗原与佐剂混合均匀，无分层现象；5. 实验数据分析表明，抗原制备成功率较高。
六、实验总结本次实验成功制备了所需抗原，掌握了抗原的制备方法、纯化技术和佐剂的使用。
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抗原亲和纯化
抗原亲和纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，其基本原理是利用抗体与抗原相互作用的特异性，将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合，然后通过洗涤、洗脱等步骤，最终得到纯净的目标蛋白。
本文将介绍抗原亲和纯化的基本原理、常见的实验步骤和注意事项。
一、基本原理
抗原亲和纯化的基本原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合，将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合，然后通过洗涤、洗脱等步骤，最终得到纯净的目标蛋白。
抗原亲和纯化的优点是选择性高、纯度好，适用于大多数生物大分子的分离和纯化。
二、常见的实验步骤
1. 抗体制备：制备与目标蛋白特异性结合的抗体是抗原亲和纯化的关键。
抗体可以从动物血清或通过酶联免疫吸附法制备。
制备抗体时需要注意抗原的质量和纯度，以及抗体的选择性和亲和力。
2. 抗原结合：将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合。
可以通过直接结合或间接结合的方式进行抗原结合。
直接结合是将抗体直接固定在固相载体上，然后加入含有目标蛋白的混合物，目标蛋白与抗体结合。
间接结合是先将含有目标蛋白的混合物与抗体结合，然后将结合复合物固定在固相载体上。
3. 洗涤：将非特异性结合的成分洗掉，保留特异性结合的目标蛋白。
洗涤的条件需要根据抗体和目标蛋白的特性进行优化，一般采
用高盐、低pH、有机溶剂等条件进行洗涤。
4. 洗脱：使用适当的溶液将目标蛋白从抗体上洗脱下来。
洗脱
的条件需要根据抗体和目标蛋白的特性进行优化，一般采用酸性、碱性、高盐、有机溶剂等条件进行洗脱。
5. 确认纯度：通过SDS-PAGE、Western blot等方法确认纯度。
如果需要进一步提高纯度，可以通过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等方法进行后续纯化。
三、注意事项
1. 抗体的选择应根据目标蛋白的特性进行优化，包括亲和力、
特异性、反应温度、抗原表位等因素。
2. 抗原的纯度和质量是影响抗原亲和纯化效果的关键因素，需
要在抗原制备和纯化过程中进行严格控制。
3. 洗涤和洗脱的条件需要根据抗体和目标蛋白的特性进行优化，一般需要进行多次试验才能确定最佳条件。
4. 确认纯度时需要选择合适的方法，以确保得到准确的纯度结果。
综上所述，抗原亲和纯化是一种常用的生物大分子分离和纯化方法，其基本原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合。
在实验过程中需要注意抗体的选择、抗原的纯度和质量、洗涤和洗脱条件的优化以及纯度的确认，以最大限度地提高抗原亲和纯化的效果。