体细胞克隆牛的研究进展(综述)

体细胞克隆牛的研究进展

1997年，体细胞克隆绵羊多莉的诞生，改变了以往教科书中的哺乳动物已分化的体细胞不能重新去分化而重获全能性的概念。1998年，体细胞克隆牛获得成功。体细胞克隆动物的成功是几十年来生物学领域的重大突破之一，它引起了社会的广泛兴趣和关注。因为该技术可能对未来农业、医学和人类自身产生重大影响。

为了使我国科学家能抓住机遇，在体细胞动物克隆领域研究中尽快加入国际竞争的行列并走在国际前列，国家自然科学基金委员会于1998年不失时机地设立了“家畜体细胞无性繁殖的研究”的重点项目。这个项目，不仅可为发育生物学的基本理论研究提供很好模型，更重要的是在我国建立家畜克隆技术并在未来国民经济发展中发挥重要作用。因此，该项目既具有科学上的前沿性，又符合国家重大发展需求。

“家畜体细胞无性繁殖的研究”项目（批准号39830280）是国家自然科学基金委员会的重点科研项目。1999年、2000年和2002年，体细胞克隆山羊、转基因克隆山羊和克隆牛分别在我国降生。2002年2月27日同行专家在中国科学院动物研究所对该项目进行了验收与鉴定。专家们对项目成果给予了高度评价，一致认为，通过该项目的研究，我国的家畜克隆技术已迈入世界先进水平。

克隆牛研究是由中国科学院动物研究所生殖生物学国家实验室克隆动物研究组与山东五里墩中大动物胚胎工程中心合作完成的。通过成批体细胞克隆牛的研究，我国科学家已建立了从家畜体细胞培养、卵母细胞成熟、卵子去核、重构胚构建、胚胎体外培养、胚胎移植等成套的较成熟的操作方法和规程，标志着我国成为继英国、日本、新西兰和美国等国家之后，掌握体细胞克隆家畜关键技术的少数国家之一。体细胞克隆牛和克隆羊的成功，使我国在动物胚胎工程高科技领域已走在国际前沿。该项目的研究可能为未来畜牧业的发展提供一个新的增长点。特别是奶牛克隆胚胎应用技术，在我国奶牛业十分落后的条件下，一旦提高效率并投入生产应用，将对畜牧经济发展产生重要影响。因为供核样本牛的性别和生产性能可以人为选定，原料成本很低，取材方便利于工厂化生产。这些优点使我们可以选择经济价值最高的个体进行“复制”，而且可以大批量生产和大面推广。

（一）发展回顾

动物胚胎移植技术历时20年的发展，对牛来说，在无手术情况下，可一次冲卵30枚，平均可用胚胎数为5.5枚/头。超数排卵和胚胎移植（MOET）育种计划在至少8个国家得到全面实行，遗传改良进展比预期提高了10%。奶牛胚胎移植的总数正在逐年增加，全球1997年移植胚胎数接近460,000，现在每年大约500,000枚左右。在美国，奶牛生产群中有0.2%的母牛是通过胚胎移植获得，但95%以上的种公牛和优良种母牛是胚胎移植获得的。“七五”和“八五”期间，我国“863”计划、国家攻关计划、农业部重点攻关计划和部分省市的研究计划都重点支持了动物胚胎移植技术的研究与开发，包括胚胎分割、卵母细胞体外成熟、体外人工授精、核移植技术等，并利用体外受精和胚胎移植技术繁育了大量的优良种畜，如内蒙古共生产良种牛胚胎3万多枚，建立中试移植基地4处，几年来共移植受体1000余头（次），获得试管牛犊300余头；新疆与宁夏已建成700余头供体牛的牛胚胎移植产业化基地，生产良种牛胚胎1530余枚，进口安格斯肉牛胚胎1300余枚，移植受体牛300头，冻胚平均妊娠率40%以上；北京、河南、山东、黑龙江、广西等地也获得了较大数量的胚胎移植优

质牛。内蒙古在国家计委的支持下，建立了10万枚优质羊的胚胎移植基地，1000多只试管羊已经出生；国家计委还先后支持了北京市奶牛中心、江西金牛集团、广西大学等建立奶牛胚胎移植中心并进行大规模的产业化奶牛胚胎生产。目前，我国奶牛的胚胎移植数量已接近10,000枚左右/年，在发展中国家处于先进水平。据不完全统计，我国有以胚胎移植技术为核心的生物技术公司32家。由中国奶牛协会、中国农业大学、中国农业科学院畜牧研究所、北京奶牛中心等单位承担的“中国荷斯坦奶牛MOET 育种体系的建立与实施”项目以及内蒙古大学和广西大学等主持的“牛体外受精技术的研究与开发”项目，研究开发结果达到了国际先进水平，在2000年分别授予了国家科学技术发明二等奖。

1997年2月,世界上第一只体细胞克隆绵羊—“多莉”在英国诞生。这一成果开创了哺乳动物体细胞克隆的里程碑。一时间，世界范围内刮起了强劲的“克隆”旋风, 体细胞克隆小鼠、山羊、牛、猪等都相继出世。我国科学家在利用胚胎细胞作为核供体来产生克隆动物的研究方面一度处于国际先进水平，新疆畜牧科学院、西北农业大学、东北农业大学等利用胚胎细胞克隆生产出了克隆牛、克隆羊和克隆猪；特别是在1995年，获得过45只再克隆的胚胎克隆山羊，是当时世界上最大的胚胎克隆羊群体，但我国没能够在体细胞克隆技术方面获得突破。1999年10月中科院发育所和扬州大学合作成功地克隆出转基因体细胞克隆山羊；同年，我国台湾省畜产研究所在克隆猪上取得了成功；2000年6月西北农林科技大学再次成功获得了体细胞克隆山羊“元元”和“阳阳”，标志着我国动物体细胞克隆技术的崛起。

（二）主要进展

2001年我国动物胚胎移植技术再次取得重要进展，仅奶牛胚胎移植的数量就达到11,000余枚，其中直接从国外进口的优良胚胎数量接近5000枚。同年，我国优良水牛的胚胎移植成功率也获得突破性进展。优良种绵羊（如多赛特）和山羊(如波尔山羊)的胚胎需求量激增，全年胚胎移植数量已超过20,000枚。2001年我国不仅在奶牛胚胎移植的数量上有很大发展，而且技术水平也已经达到国际先进水平，高产奶牛超数排卵技术每头生产可用胚胎6-8枚，鲜胚移植妊娠率达到60%，冷冻胚胎移植妊娠率为50%以上。

2001年我国在体细胞克隆牛方面也取得了突破性进展。2001年10月克隆奶牛在深圳市绿鹏公司转基因动物繁殖基地诞生。2001年11月山东莱阳农学院的科学家成功地克隆了2头健康的日本黑牛“康康”和“双双”。2002年3月至5月，中国科学院动物研究所和中国农业大学的科学家们已经能够在国内成功生产体细胞克隆牛胚胎，并已开始了较大规模的体细胞克隆胚胎的移植试验，其各项技术指标均已接近或达到国际先进水平。

何谓牛(动物)克隆?牛(动物)克隆(COW animalcloning)是指通过细胞核移植进行个体的先天性复制。获得的后代其遗传性状与施祖细胞是一致的，将未完全分化的胚胎细胞进行核移植称胚胎细胞克隆(embryonic cell cloning)；将已分化的体细胞进行核移植称体细胞克隆(comatic cell cloning)。国际上家畜核移植的最初阶段，用于牛克隆的供核细胞都来源于早期胚胎的卵裂球，因为这些卵裂球被认为是相对未分化的细胞，易于进行克隆。然而，这一方法的效率却相对较低。由于早期胚胎的细胞数少，难以获得大量的供体细胞核，因此最终获得的基因型完全一致的克隆个体数很有限；另一方面，由于早期胚胎的性别以及遗传特性难以控制，所以克隆出来的动物个体不一定是我们所需要的。随后，研究人员考虑到用未分化的胚胎干细胞作为供核体细胞，这可以部分解决以上两个方面的问题，然而到目前为止，尚未获得牛的胚胎

干细胞，只获得了类胚胎干细胞，用这种细胞进行核移植后的胚胎仅能在体内发育到60天。1998年，“科学”杂志报道了美国科学家用培养的携带外源墓因的胎儿成纤维细胞作为供核获得的4头转基因克隆牛(其中一头在出生后5天死亡)。这是第一次报道用培养的牛分化细胞作为供核的核移植研究，而且该研究所用的细胞经体外转染后携带了B—半乳糖苷酶基因，这就为以后大规模开展转基因生物反应器研究奠定了一个基础。但该实验中所用细胞是易于在体外培养及传代的牛胎儿成纤维细胞，而不是完全分化的体细胞。7个月后，“科学”杂志再次报道日本科学家的克隆牛研究，这次用的是在体外培养数代后的完全分化的卵丘细胞和输卵管上皮细胞。他们在移植10枚重构囊胚后，共获得了8头克隆牛，其中4头不久后死亡。随后，体细胞克隆牛在新西兰、法国、澳大利亚、德国、美国、加拿大等国家获得成功。至此，体细胞克隆牛技术已建立，但对于克隆牛过程中遇到的一些问题，还尚不清楚，如克隆动物早衰、是否各种细胞类型均适合于克隆、克隆牛为何会出现这么多死亡现象等，因此又出现了不少针对这些问题的研究报道。

我国的克隆技术研究始于六十年代，早在1963年，童第周等首次报道了鱼类细胞核移植，利用其自制的显微注射器成功地在金鱼的两个亚科(Carassiuseuratus和Rhodeus sinensis)上进行细胞核移植，在国际上首创核移植培育鱼类新品种的方法。在80年代末，我国开始了哺乳动物胚胎细胞克隆研究。90年代是我国科学家利用胚胎细胞进行动物克隆的鼎盛时期，西北农林科技大学、中国科学院发育研究所、中国农科院、江苏省农科院、东北农业大学、广西农业大学和湖南医科大学等科研单位的科研工作者相继胚胎细胞克隆出了牛、羊、猪、兔及小鼠等几种动物。

1996年，西北农林科技大学生物工程研究所李雪峰等报道了用奶牛的8-32细胞期胚胎细胞作核供体进行核移植，获得了一头胚胎细胞克隆牛犊；2000年，东北农业大学李光鹏等用猪的胚胎细胞克隆了猪；2001年，湖北省农业科学院生物技术研究所赵浩斌等以湖北白猪卵母细胞为核受体，杜洛克胚胎卵裂球为核供体，进行了猪胚胎细胞核移植，获得了杜洛克胚胎克隆猪。1998年后，我国科学家开始了哺乳动物体细胞克隆的研究，先后在山羊、奶牛等家畜上取得了成功。1999年，中国科学院发育生物学研究所和扬州大学畜牧兽医学院协作，用胎儿成纤维细胞作为供核细胞，在国内首次获得了体细胞克隆山羊；2001年5月，他们在已经获得的乳腺特异性表达人促红细胞生成素(rhEPO)成年转基因山羊(Caprahircus)的基础上，取其耳尖成纤维细胞和卵泡颗粒细胞，进行体外传代培养，然后将这种培养的转基因山羊的体细胞进行核移植，又获得了2只携带rhEPO外源基因的克隆山羊。同年6月，西北农林科技大学也获得了成年体细胞克隆山羊。1999年后，我国有多个单位相继开展了牛的体细胞克隆研究。1999年，中国科学院动物研究所刘冀珑等报道了用非休眠期成年牛耳成纤维细胞用于核移植，获得了牛体细胞克隆胚胎，移植后尚未产仔。2001年，用卵丘细胞作为供核体细胞在新西兰构建的重构胚，在中国深圳进行胚胎移植的一头克隆牛在深圳绿鹏公司出生，但不幸在喂奶的时候被呛死了。之后，莱阳农学院也培育出了两头克隆牛，是由该校博士生在日本构建的重构胚，到中国莱阳进行胚胎移植的。然而真正中国自主的体细胞克隆牛是由中国科学院动物研究所与山东曹县中大胚胎工程中心合作完成的，试验用230枚重构胚移植112头受体牛子宫，其中26头牛妊娠，流产14头。从2002年1月18日喜获第一头克隆牛犊到2月11日共有12头受体牛产犊14头，现存活5头。所有克隆牛犊既有奶牛又有黄牛，既有母牛又有公牛，经微卫星分析(DNA 检测)证明13头克隆荷斯坦牛犊的遗传物质都来源于同一个核供体603号母牛；]头克隆的盖普威公黄牛犊，遗传物质来源于18号盖普威种公牛，所有克隆牛犊与代孕

母牛没有遗传关系。2002年5月从报纸上见到由中国农大克隆成了奶牛寄母生出一头黄牛的好消息，可以说我国动物克隆技术已跻身国际先进水平。克隆研究的意义不仅在于动物克隆本身，它涉及一系列的重大科学问题，如体细胞的全能性，核质关系等问题。这些问题的解决将为最终揭开生命之迷提供帮助。因此动物克隆作为“火车头”起着牵生命科学一部分领域发展的作用，动物克隆研究在家畜胚胎产业化方面还展现了广阔的应用前景，有望在不远的将来产生推动行业性发展的关键技术。大家知道，我国人们的饮食结构，随着国家的发达富强，必定对牛奶的需求量会大幅度的增加，因此，奶牛业是一个亟待发展的“白色产业”，但我国畜牧业由于先天不足，技术落后，若依靠传统育种繁殖的方法，需要几十年才能赶上目前发达国家的水平。因此我们发展中国家必须找到一种跨越传统技术，直接使用新一代的高新技术来改造我国低产奶牛为高产奶牛，发展创新途径，“每人一杯奶工程，可以强壮一个民族”，这是振兴中华的大事，必须狠抓不放，一抓到底。

近年来,由于体细胞克隆技术在畜牧业生产、疾病治疗、生物学基础理论研究及濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值,克隆效率成为科学界研究的热点问题。对克隆技术的相关影响因素进行了综述,研究表明,不同细胞系影响到体细胞克隆牛效率,胎儿细胞和颗粒细胞重构胚的囊胚发育率、犊牛成活率比成年成纤维细胞高。关于卵母细胞和克隆胚胎冷冻保存的研究表明,玻璃化冷冻法可以用于克隆胚胎以及卵母细胞的冷冻保存。在此基础上,讨论了国际上哺乳动物体细胞克隆研究新进展和体细胞克隆的效率,指出体细胞克隆中亟待解决的问题。

2003年10月8日3时18分，中国首例体细胞克隆牛的胚胎移植后代克隆牛“蓓蓓”在山东莱阳农学院动物胚胎工程中心实验场呱呱坠地。克隆牛“蓓蓓”是采用最新的玻璃化超快速冷冻技术①和超数排卵技术②繁殖的新型克隆牛。克隆牛“蓓蓓”是我国成功繁殖的首例和第二例胎儿皮肤上皮细胞克隆牛“康康”和“双双”的后代。

该项成果通过对体细胞克隆牛“康康”和“双双”的初情期、性成熟、繁殖适配期及体成熟等进行了系统的跟踪观察与检测；进行了超数排卵、胚胎玻璃化超快速冷冻保存及解冻移植试验；并进行了人工授精试验。目的是检测体细胞克隆牛是否与正常繁殖牛一样，对外源激素FSH有较好的应答能力和超数排卵的能力；检测体细胞克隆牛胚胎对外界因素影响的抵抗能力；检测其胚胎移植到其他受体牛的子宫内，是否具有正常的着床能力和发育成胎儿的能力；检测体细胞克隆牛是否具有正常的妊娠产犊能力。

“康康”5月龄时进入初情期，12月龄时进入性成熟期，14月龄时达到适配年龄，发情周期20.3±1.03d。“双双”6月龄时进入初情期，12月龄时进入性成熟期,15月龄时达到适配年龄，发情周期19.26±1.10d；两者发情持续时间均为18h，生长发育正常。根据体重检测结果，两者尚未达到体成熟。2001年，我国研究人员对“康康”和“双双”进行了超数排卵，于2003年1月2日分别获得6枚和10枚胚胎，符合国际胚胎移植标准的可用胚胎（这是国际上首次对体细胞克隆牛进行超数排卵处理试验并获得可用胚胎）分别为4枚和9枚，平均可用胚胎6.5枚，胚胎形态符合正常胚胎的形态学特征。各取2枚1级胚胎应用EPS20玻璃化液进行玻璃化超快速冷冻处理，解冻后分别移植给4头同期发情处理的中国荷斯坦奶牛的黄体侧子宫角内，结果1头妊娠，并且产下一头健康犊牛“蓓蓓”（♀）。在其超排采卵后的第一次发情即进行了人工授精，结果均获得妊娠，产下了体细胞克隆牛的自体繁育后代“健健”（♀）和“壮壮”（♂）

试验结果表明：体细胞克隆牛“康康”和“双双”①生长发育正常，具有正常性

行为和正常的自然发情规律；②对外源生殖激素FSH和PGF2α具有较好的应答能力和超数排卵的能力；③能够正常地妊娠、产犊，繁殖机能正常；④证明体细胞克隆牛胚胎对外界影响因素同样具有抵抗能力；⑤进一步证明该项体细胞克隆技术的可靠性和先进性。采用超数排卵技术和玻璃化超快速冷冻技术的“蓓蓓”的降生证明，体细胞克隆牛“康康”和“双双”与正常繁殖母牛一样对外来激素具有较好的应答能力；体细胞克隆牛经超数排卵获得的胚胎移植后，具有正常的发育成胎儿的能力；“蓓蓓”的降生，该项成果首次应用玻璃化冷冻保存技术对体细胞克隆牛超排胚胎进行冷冻保存，并获得了健康的犊牛；在国内首次获得体细胞克隆牛自身繁殖后代。在体细胞克隆牛的超数排卵、胚胎冷冻和移植并获得健康犊牛方面的研究达到了国际领先水平；在体细胞克隆牛的自身繁殖方面达到国内领先水平。对于进一步研究和推广体细胞克隆技术具有重要的理论和实践意义。

该项成果进一步证明了体细胞克隆技术的可靠性和可行性。克隆技术是一项高新胚胎生物技术，它克服了胚胎移植和胚胎分割生产同质优质动物的数量限制。其优点在于：一是它能够几乎完全地保留被克隆动物的所有优良性状；二是克隆技术为良种动物的大批量体外复制奠定了技术基础；因为对于动物来说，它的体细胞（皮肤细胞等）不计其数，只需采集少量细胞即可在体外无限制地克隆复制；为高产奶牛及高档优质肉牛的产业化发展提供技术支撑；并且可用来控制牛的产犊性别，获得大量相同性别优质牛后代；三是克隆技术可提高转基因技术的效率，扩大转基因生物反应器动物和转基因器官移植动物后代的数量；四是为人类治疗性克隆研究、克隆胚胎干细胞的建立及再生医学研究提供依据；五是增进对细胞分化、细胞全能性和细胞核和细胞质之间的相互作用关系等细胞生物学、分子生物学、发育生物学、生殖生物学有关机制的认识和理解。

国际上牛胚胎移植应用现状，对于克隆的东西搬到人们的餐桌上这一举动仁者见仁，然而就该项克隆技术来讲最常见的克隆技术就是将动物的卵子中的细胞核剔除，然后植入被克隆动物的基因，接着通过特殊手段刺激此细胞分裂，最后将这个开始发育的细胞植入“代孕母亲”体内，从而实现无性繁殖。

目前由于克隆技术依然不成熟，目前的成功率也不过10-15%。研究人员希望，在未来能将克隆技术的成功率提高到接近60%，从而达到人工受精繁育技术的水平。克隆动物面临的最大问题就胎儿往往会长得太大，结果让克隆体和代孕母体都面临严重风险。

1997年2月，英国人用母羊乳腺细胞克隆出绵羊多利，1999年，以华裔科学家杨向中为首的研究小组利用从一头13岁母牛（相当于人类80多岁）耳朵上取出的细胞克隆出小牛艾米。它既是美国有史以来第一只克隆动物，也开创了用非雌性生殖系统细胞克隆的先河。此后，杨向中小组又利用这头高龄母牛克隆了“戴西”等三头克隆牛。时隔两年，“戴西”通过自然繁殖，产下一头健康牛犊“诺曼”。上述实验说明，老年克隆牛的后代照样能够正常发育、怀孕和产犊，因此，老年动物克隆后代的生理年龄与其“基因母亲”无关。

为消除公众戒心，美国科学家将克隆肉牛的肉与天然繁殖肉牛的肉进行比较，同时将克隆奶牛所产的奶与天然繁殖奶牛所产的奶进行比较。结果发现，克隆奶牛和天然繁殖奶牛所产奶在脂肪、蛋白质、乳糖、固体物以及尿素含量上没有明显区别，抗体成分也极其相似。而在对牛肉的研究中，克隆牛和天然繁殖牛的肉类湿润度，粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和脂肪酸等的含量上基本一致。不过，克隆牛在肥肉含量、肠系膜脂肪含量和脂肪酸含量上略高于自然繁殖的牛，不过这些指标都在美国食品管理机构允

许的范围内。克隆技术与现有的相关技术比较，克隆技术具有四大优点：一是可以控制性别；二是成本低；三是克服国外引进优良品种的限制；四是可快速更新换代，扩繁优良品种。克隆技术在奶业中有重要的应用前景，对加速畜种改良、提高乳品质量有着重要的作用。应用体细胞克隆技术可以不受限制地保存某些个体的优良性状，并迅速地扩大优良个体的数量；克隆技术与转基因技术结合，可以大大提高转基因的效率，加速实现动物遗传的改造；克隆技术与乳腺反应器技术结合，可以直接从乳品中生产药用蛋白，或改良乳品质量。我们只要遵循科学规律，与日俱进，开拓创新，任何艰难和科学堡垒，如克隆牛中存在的流产率高和存活率低等问题都一定能够被最后攻克。哺乳动物体细胞克隆技术,是指通过显微操作去核、核供体细胞的融合、重构胚激活等实验室手段,将某种类型的体细胞和核受体(一般是成熟卵母细胞)进行体外融合重构以形成克隆胚胎，再将克隆胚进行胚胎移植给代孕的母畜,达到大量生产遗传同质哺乳动物的一种生物技术。目前，动物克隆技术还没有完全成熟，因此，主要是用于生产具有高附加值的转基因动物、优良种畜和保护濒危动物遗传资源方面。动物胚胎移植主要是通过对优良供体母畜作同期排卵处理和体内胚胎生产或体外人工授精（IVF）的方法，以大量获得优良的动物胚胎后再将其移植给普通代孕受体母牛进行快速繁殖优良动物的生物技术。胚胎移植技术主要用于快速扩大优秀种公牛和核心母牛的数量。尽管单个胚胎的生产成本较高，但由于种公牛和种母牛较高的经济价值和社会价值，以及利用胚胎移植在育种方面可以获得同胞或同卵双生牛进行后裔测定等优势，因此，该技术在种公牛的选育和优质核心母牛群的培育以及加快育种步伐方面均具有极大的优越性。

(名词解释: ①玻璃化超快速冷冻技术：它是最简洁、最快速的胚胎冷冻保存技术，冷冻过程不超过1 min，不需要昂贵的程控冷冻仪器，是促进胚胎移植产业化的关键技术之一。该项目采用玻璃化冷冻体细胞克隆牛胚胎移植产犊，在世界上尚属首例。

②超数排卵：也简称“超排”，是指将供体母牛经激素处理，使其发情，并能排出数量较多的发育成熟的卵子，经合理的人工授精方法，可以获得数量较多的可移植胚胎)

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