链霉菌诱变育种方法综述
链霉菌诱变育种方法综述摘要：主要论述了链霉菌的4种诱变方法，即物理诱变、化学诱变、空间技术诱变和复合诱变。
同时对这4种方法的原理及具体操作方法进行了简要的阐述。
其中物理诱变中的紫外线诱变方法是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂。
化学诱变方法中的EMS、8-Mop、NTG和LiCI也取得了很好的效果。
近年来用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器，进行搭载微生物材料的空间诱变育种是培养新的生物菌种的一种有效方法。
将以上诱变方法结合起来使用，可取得更好的诱变效果。
关键词：链霉菌；育种；诱变放线菌是产生抗生素活性最大的一类微生物，迄今已在工业、医学、农业上都有利用抗生素成功的实例，而链霉菌又是放线菌中抗生素的主要产生菌，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，是重要的资源微生物，但在链霉菌中普遍存在遗传不稳定性，而引起抗生素产量下降。
因此，各国学者不断研究提高抗生素产量的方法，已期获得更大产量的抗生素，而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。
诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法，因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。
本文就链霉菌诱变育种的几种方法做了简要论述。
1 物理因子诱变方法1．1 紫外线诱变法紫外线是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂，大约有80％的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。
具体操作方法是将斜面培养物制备成单孢子悬液或原生质体放在磁力搅拌器上，开紫外灯(3ow，距30cm)照射不同的时间后，涂平皿(为防止回复突变，紫外线诱变后的操作应在红灯下进行)进行培养，然后挑取不同形态的单菌落接斜面，进行摇瓶发酵筛选。
用此种方法，以土霉素产生菌龟裂链霉菌Lf-2为出发菌株，经过紫外线诱变后，筛选的菌株于出发菌株相比发酵效价提高了17．4％，发酵指数提高了23．9％。
黄世文等对淡紫色吸水链霉菌进行紫外线诱变，所获菌株发酵液对水稻纹枯病和恶苗病的抑杀效果比原始菌株明显提高，并且证实用菌悬液涂培养基之后先在28~C培养24 h，再在紫外灯下诱变菌株比涂后直接照射和直接照射菌悬液所获得的诱变菌株的生测效果好，这可能是微生物在培养24} 后，正处在分裂生长的初始阶段，当受到外部“能量”作用时较易发生变异。
孟勇等以带棒链霉菌为出发菌，经紫外线诱变，筛选到1株抗20xl0-S~mL的舒巴坦钠突变株my51，my51菌株产克拉维酸的效价达到834．7x10~g／mL，比出发菌株提高了1．18倍。
张雪松以金色链霉菌为出发菌株，经溶菌酶作用制备原生质体，然后以紫外线对原生质体进行诱变处理，获得四环素高产菌株，第20号菌株相对效价为1．284。
1．2 激光辐照诱变法一定量的激光照射生物体，其能量被生物大分子直接或间接吸收以后，可引起分子激发光解离、分解及生物大分子的自由基反应等，从而导致DNA分子或染色体发生畸变，使生物性状发生突变，这为选育和改良生物品种，提高生物品质提供了有利条件。
1．2．1 He—Ne激光诱变法He—Ne激光辐照后引起抗生素产量变化的机理尚不太清楚，但是Kapho曾通过实验证明在一定的能量密度范围内，波长在610~850nm的He-Ne激光对细胞内DNA合成有刺激作用，即加速细胞内DNA合成率。
陈五岭等报道He—Ne激光对红霉素链霉菌孢子及原生质体的诱变效应。
分离到红霉素发酵单位提高27．2％的辐照株。
研究了He-Ne激光对金霉素(S．aureofaciens，简称sa)孢子的诱变效应。
结果表明，小剂量He-Ne激光对Sa孢子的萌发具有促进作用，大剂量He-Ne激光的照射对sa的孢子具有致死作用；激光诱变sa孢子的正变率最高达到6．6％。
采用He—Ne激光对金霉素链霉菌原生质体诱变处理，再生菌株产抗能力与其本菌株相比，四环素产量平均提高9．32％，最高提高20．6％。
He-Ne激光和聚乙二醇对红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合，融合子产抗能力与亲本相比，最多提高了28．04％，且具有良好的遗传稳定性。
1．2．2 铜蒸气激光诱变育种吴振倡等首次报道铜蒸气激光辐照林肯链霉菌，获得高产菌株，最高发酵单位比对照株提高15．8％。
同样用铜蒸气辐照天蓝淡红链霉菌，获得发酵单位比对照株提高14．7％高产株，最高发酵单位曾达国内最高水平。
1．3 微波诱变育种法微波是一种高频率的电磁波，利用微波进行诱变具有设备简单、操作简便和安全可靠的特点。
其诱变原理是能刺激水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。
在2 450 MHZ频率作用下，水分子能在1 s内180。
来回震动24．5×1O 欠。
这种震动能引起摩擦，因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦，孢子内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损，使得DNA结构发生变化，从而发生遗传变异；微波具有传导作用和极强的穿透力，在引起细胞壁分子间强烈震动和摩擦时，改变其通性，使细胞内含物迅速向胞外渗透。
在试验中，究竟是微波辐照直接作用于微生物DNA引起变异，还是其穿透力使细胞壁通透性增加，导致核质变换而引起突变，目前尚不明了，有待进一步研究。
陈力力采用微波诱变方法对井冈霉素生产菌株进行诱变处理，挑取单个菌落摇瓶初筛、复筛，测定化学效价，获得4株平均效价比出发菌株分别高出17．5、15、2O和21．7％的突变株。
采用沙土管长时间保存后连续传代4次，代间效价差异不明显，遗传性能稳定。
1．4 离子注入诱变育种方法离子束是一种新的诱变源，离子注入法是近年来微生物育种中较新的一种育种方法。
其诱变原理是微生物在核能离子注人后，受到不同程度的损伤，大到整个细胞形态、各种亚细胞结构的变化，小到组成细胞的生物大分子的变形，从而导致基因突变。
它对生物体是集能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷中和与交换于一体的联合作用。
因此，它与目前其他的诱变源相比，可以获得更高的突变率和更广的突变谱，由于其能量、质量、电量、剂量具有多种组合可能，因而可以在不同的作物及菌种的诱变育种中发挥巨大的作用。
例如，向砥等利用离子注人选育高产壮观链霉菌，获得高产菌株，效价较出发菌株提高了102．3％。
桑金隆等通过离子注入诱变选育之江菌素产生菌，筛选到1株高产菌株，其效价比出发菌株提高4倍多。
1．5 入射线诱变育种法魏赛金等采用不同剂量的们Co 射线，对南昌霉素产生菌诱变处理，初筛摇瓶产量正突变率达21．08％；复筛摇瓶发酵效价比出发菌株提高50％以上的有1O株，占初筛菌株的5％；连续4批摇瓶发酵试验平均产量比出发菌株的产量提高50％以上；有6个菌株摇瓶产量分别比出发菌株提高60％，其中3株平均摇瓶产量比出发菌株提高70％以上。
王海彬以阿维链霉菌为出发菌株进行6OCo入诱变处理后，筛出缬氨酸缺陷型回复突变株。
其摇瓶发酵单位可达到1 6OO g／mL，比出发菌株提高33％。
还有一些其它的诱变方法，如离子束诱变法、快中子诱变法和通电处理法等，这些诱变方法也取得了很好的诱变效果。
2 化学因子诱变方法化学诱变主要是导致碱基对的转换、缺失和易位等，如氯化锂诱变，普遍认为是它导致AT—GC碱基对的转换或导致碱基的缺失。
甲基黄酸乙酯(EMS)诱导的突变株大多数是点突变，首先是鸟嘌呤的O位置被烷基化，在DNA的复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基的替换，~IG：C变为A：T。
化学诱变剂的种类很多，如烷化剂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等。
当前在链霉素诱变育种上应用的主要是甲基磺酸乙酯(EMS)、LiC1、NaHSO，、亚硝基胍(NTG)、盐酸羟胺、5一锈尿嘧啶(5一BU)、乙烯亚胺(EI)、亚硝酸(NA)和8一甲氧基补骨脂素(8-Mop)等，其中EMS、8-Mop、NTG和LiC1等都取得了很好的效果。
如利用共突变理论，采用EMS诱变剂进行诱导处理，使诱变孢子的DNA产生高频率的突变，筛选到高产菌株，使发酵单位比出发菌株提高96．4％。
蒋世春报道，经8一甲氧基补骨脂素诱变天蓝淡红链霉菌，获得1株摇瓶产量稳增7．47％的高产株。
郎莉莉用同样的方法诱变肉桂链霉菌，曾获得摇瓶发酵产量增幅达7．5％的高产株，并已在国内应用。
3 空间技术诱变育种微生物空间生物学效应研究的是空间环境因子(如微重力、强辐射和低真空等)对活的微生物菌体的作用及生物对这种作用所做出的反应变化。
因此，运用空间技术进行的微生物诱变育种是培养新的生物菌种的一种有效方法。
近年来，人们利用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器，进行搭载微生物材料的空间诱变育种。
通过外层空间特殊的物理化学环境，引起菌种的DNA分子的变异和重组，从而得到生物效价更高的高产菌种。
如王璋等将生产微生物谷氨酰胺转氨酶(MTG)链霉菌wzf．L—m。
的孢子和斜面培养菌体搭载“神舟”四号无人飞船，并在斜面中添加诱变剂亚硝基胍(NTG)。
结果筛选到5株性能优异、遗传性状稳定、产酶活力提高了30％以上、能够稳定发酵和生产高于3．5 u ／mL的MTG，集中体现了航天飞船搭载的空间诱变育种技术效果。
北京、上海所进行4年联合攻关，在“神舟”一号、二号、三号和四号上连续进行菌种太空搭载诱变，筛选并获得高发酵单位的HT一7菌株，使产品品质大幅度提高，终于产出了“新泰乐系列产品”。
骆爱群等在返回式卫星上进行搭载NIKKO霉素产生菌圈状链霉菌，结果NIKKO霉素产生菌效价提高13％～18％。
4 复合诱变育种采用两种或两种以上的方式进行诱变育种，在链霉菌的诱变育种上已经取得了很好的效果。
如贺筱蓉等采用紫外同平板梯度浓度的亚硝基胍、纯铜蒸气混合诱变，筛选到高产菌株效价提高53．2％，其原理可能是激光对经理化处理的微生物细胞有修复作用，使正突变率提高。
但也有复合诱变使效果降低的例子。
如吴振倡等在相同的条件下铜蒸气辐照龟裂链霉菌比其随后又用LiC1复合处理效果好，可能是与LiC1提高了细胞的修复系统的活性有关。
现具体介绍几种复合诱变方法的例子：齐秀兰等以妥布霉素产生菌黑暗链霉菌ATCC17920为出发菌株经紫外线处理，获得产量较高的稳产菌株UV一59，又对其高温处理，得到1株T一541菌株，再对其进行原生质体制备，分别用uV、uV加LiC1以及亚硝基胍NTG诱变原生质体，获得4株高产菌株其效价比原株提高115％～150％。
冀伟等应用统计学对林肯链霉菌诱变育种进行研究，证明UV+5一BU效果明显优于单独的紫外诱变。
王金发等用UV+亚硫酸氢钠诱变龟裂链霉菌的原生质体获得1株产率提高58％的菌株。
李永泉等利用激光和微波两种物理因子，对去甲基金霉素产生菌一金霉素链霉菌进行诱变处理，筛选得到高产株，使发酵效价提高了65．4％。
5原生质体诱变在工业微生物育种中的应用进展5.1 在酶制剂菌种选育中的应用酶制剂是活的有机体产生的有催化活性的蛋白质,是所有新陈代谢过程必不可少的要素。
链霉菌诱变育种方法综述
链霉菌诱变育种方法综述陈立梅;汪旭;李启云;杨石嶂;杨信东【期刊名称】《吉林农业科学》【年(卷),期】2006(031)002【摘要】主要论述了链霉菌的4种诱变方法,即物理诱变、化学诱变、空间技术诱变和复合诱变.同时对这4种方法的原理及具体操作方法进行了简要的阐述.其中物理诱变中的紫外线诱变方法是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂.化学诱变方法中的EMS、8-Mop、NTG和LiCl也取得了很好的效果.近年来用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器,进行搭载微生物材料的空间诱变育种是培养新的生物菌种的一种有效方法.将以上诱变方法结合起来使用,可取得更好的诱变效果.【总页数】2页(P62-封三)【作者】陈立梅;汪旭;李启云;杨石嶂;杨信东【作者单位】吉林省农业科学院,吉林,公主岭,136100;吉林农业大学农学院,长春,130118;吉林省农业科学院,吉林,公主岭,136100;吉林农业大学农学院,长春,130118;吉林省农业科学院,吉林,公主岭,136100;吉林省农业科学院,吉林,公主岭,136100;吉林农业大学农学院,长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S482.2【相关文献】1.一株不吸水链霉菌的诱变育种及前体对产素的影响研究 [J], 王智学;冯健;方新;于淼;蔡锐2.阿维链霉菌的诱变育种 [J], 陈金辉;郭伟群;蔡玉娟;王天科;王晓芳;宋渊3.产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的诱变育种 [J], 尤丽新;胡楠楠;班硕;孙永杰4.产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的化学诱变育种 [J], 尤丽新;胡楠楠;班硕5.产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的诱变育种 [J], 尤丽新;胡楠楠;班硕;孙永杰;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
简述诱变育种的典型流程及步骤
简述诱变育种的典型流程及步骤一、诱变育种的概述诱变育种是通过人为手段诱导植物基因发生突变，进而筛选出具有理想性状的新品种。
它可以通过物理、化学或生物学方法对植物进行诱变，使植物基因发生突变，产生新的遗传变异。
通过筛选和选择，最终获得具有经济和农艺价值的新品种。
二、诱变育种的典型流程及步骤1. 选择育种材料：选择适合诱变的育种材料是诱变育种的第一步。
通常选择普通品种、自交系或近缘种作为育种材料，以确保诱变后能够产生有用的突变体。
2. 诱变处理：诱变处理是诱变育种的核心步骤。
诱变处理可以采用物理、化学或生物学方法进行。
常见的物理方法包括辐射诱变和离子束诱变，化学方法包括化学诱变剂处理，生物学方法包括基因工程技术等。
3. 突变体筛选：在诱变处理后，需要对诱变体进行筛选，以筛选出具有目标性状的突变体。
通常可以通过形态学、生理学、生物化学等多种方法进行筛选。
例如，通过观察植株生长状况、花期、产量等形态指标，或通过测定植株的生理指标如抗病性、耐逆性等，以及通过分析植物的化学成分等来筛选突变体。
4. 突变体鉴定：在突变体筛选后，需要对突变体进行鉴定。
鉴定的目的是确定突变体的突变类型和突变位点。
常用的鉴定方法包括遗传分析、分子标记和基因组测序等。
通过鉴定突变体的突变类型和突变位点，可以更好地理解突变体的性状变化，为后续的育种工作提供依据。
5. 基因型固定：在鉴定突变体后，需要进行基因型固定。
基因型固定是指将突变体与优良品种进行杂交，通过连续的自交和选择，逐步固定突变体的基因型，同时消除不良性状和杂质基因。
这一步骤是为了确保突变体的稳定性和纯度，为后续的品种选育奠定基础。
6. 品种选育：在基因型固定后，可以进行品种选育。
根据突变体的优良性状，结合农业生产的需求，选择具有经济和农艺价值的突变体进行品种选育。
通过连续的选育和筛选，最终可以获得具有理想性状的新品种。
7. 品种测试：在品种选育后，需要对新品种进行测试。
测试的目的是评估新品种的农艺性状、适应性、产量等。
链霉素诱变育种的方案
• 2.菌丝过滤法
• 适用于真菌和放线菌 • 作用于丝状菌的孢子 • 3.高温杀菌法
• 适用于芽孢菌类
• 作用于芽孢菌类的芽孢和营养体
（三）、检出营养缺陷型
① 夹 层 培 养 法
② 限量补充培养法
③ 影印接种法
④ 逐个检出法
1.夹层培养法（延迟补给法）
2.限量补充培养法
3.影印接种法
• 需要注意两点
• 第一 防止菌落扩散和蔓延，在培养基中加入脱氧 胆酸钠 • 第二 为了克服孢子扩散而带来不纯现象，在操作 方法上改进。
4.逐个检出法
（四）、营养缺陷型的鉴 定
• 1 、鉴定方法
• 一种方法是加入一种物质测定多株缺陷型菌株 • 一种方法是测定一种缺陷型菌株对许多生长因子 的需求情况称为生长谱法
（一）、营养缺陷性的诱 变
筛选根据主次分为初筛和复筛
• 初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。 • 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离， 选育高产或其他优良菌株。 • 多级水平筛选：由于诱变产生高产突变株的频率很 低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中 常用多级筛选，一利于优良菌株的获得
（一）、初筛
• 平板菌落预筛 • 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行 筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提 高筛选工作效率。 • 摇瓶发酵筛选 • 优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条 件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。 缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑 取少，很难筛选到理想的突变株
（三）、影响诱变效果的因素
• （1）菌种遗传特性 • 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一 • 样。 • （2）菌体细胞壁结构 • 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 • 入细胞。 • （3）环境条件的影响 • 环境条件的影响包括： • ①诱变前预培养和诱变后培养 • ②温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
链霉菌LA5高产菌株诱变育种研究初报
＋ ＵＶ ｅ ｎ ４０ ｓ ｃ ａ ｄ ＮＴＧ ｉ ＋ ＵＶ ２０ ｓ ｃ ｆｒｔ ｅ ｏ ｄ，ｔ ｉｄ ａ ｄ ｔｅ ￣ｕｒｈ ｍｕｔｔｏ ６０ ｒ ｎ ａ １ ｅ ｏ ｈｅ ｓ ｃ ｎ ｈｒ ｎ ｈ ｔ ａｉｎ。ａ ｎａｌ ｏｓｔ ｅ ｍｕ－ ｎｄ ｆ ｌ ｙ ａ ｐ ｉｉ ｉ ｖ
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劳伦链霉菌的诱变育种和发酵研究
劳伦链霉菌的诱变育种和发酵研究
李朝选;周佩
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2002(27)2
【摘要】劳伦链霉菌(urentii)ATCC31255是含硫多肽类抗生素硫链丝菌肽(Tsn)的产生菌.为提高Tsn产量,本研究采用UV和NTG对劳伦链霉菌野生型进行诱变,筛选抗Cu2+、抗氯霉素或磷霉素超敏的菌株,经平皿初筛,摇瓶复筛,获得两株生产能力高于母株的菌株,即UFOM302、UCL3010.其Tsn产量较野生菌株提高58%和38%.又经种龄、接种量、通风量、补料等发酵条件的探索,突变株UFOM302最终Tsn的产量可达1900μg/ml左右,比野生型活力提高一倍,达到工业生产的水平.
【总页数】4页(P104-107)
【作者】李朝选;周佩
【作者单位】复旦大学药学院,上海,200032;复旦大学药学院,上海,200032
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1+6
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硫酸二乙酯和紫外线对金霉素链霉菌的诱变育种_黄晶
论 著文章编号:100128689(2002)0320138203硫酸二乙酯和紫外线对金霉素链霉菌的诱变育种黄晶 刘峰 刘勇(福州抗生素集团公司, 福州350002)摘要: 考察了硫酸二乙酯(DES )和紫外线(UV )对金霉素链霉菌进行诱变的效果。
其中2%DES 诱变剂对金霉素链霉菌无明显的致死效应,但在含有金霉素220μg/ml 的培养基上筛选结果表明,DES 对金霉素产生菌产生了较强的诱变效果,菌株正突变率达52%。
对金霉素链霉菌进行紫外诱变的结果表明,在营养贫瘠培养基上筛选的诱变效果较营养丰富培养基上的效果好,且遗传特性稳定。
关键词: 金霉素链霉菌; 硫酸二乙酯; 紫外线诱变 培养基; 金霉素中图分类号:Q933 文献标识码:A收稿日期:2001202212作者简介:黄晶,女,生于1972年,学士,助理工程师。
金霉素(chlortetracycline )是一相对传统的四环类抗生素,随着新型抗菌药物的不断出现,其应用范围虽逐渐减小,但其在兽用和牙科疾病治疗方面仍具有重要的作用[1]。
近年来,四环素类抗生素在非抗菌方面的研究成为一个热点[2],在抗肿瘤、抑制骨吸收、促进骨形成、促进成纤维细胞附着和扩展、治疗痤疮等方面起重要作用。
这些非抗菌作用的出现,使四环素类抗生素增加了新的临床应用价值。
本文利用DES 诱变和紫外线诱变的方法,对一生产水平的金霉素链霉菌株进行诱变,提高其生产能力。
1 材料与方法1.1 实验(1)菌种 金霉素链霉菌(Streptomyces aureo f aci 2ens )121214。
(2)斜面培养基 麸皮、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、琼脂按比例配制。
(3)检定板培养基 见药典[3]。
(4)种子、发酵摇瓶培养基 玉米淀粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、磷酸二氢钾、氯化钠等按比例配制。
(5)DES 2%硫酸二乙酯。
(6)DES 诱变中平皿再生培养基 葡萄糖、酪蛋白水解物、牛内浸膏、酵母粉、琼脂按比例配制。
费氏链霉菌遗传操作体系的优化与应用
文章编号：1001-8689(2021)02-0128-06费氏链霉菌遗传操作体系的优化与应用孙俊峰王珊刘鹏飞薛正莲*王洲刘艳(安徽工程大学生物与化学工程学院，微生物发酵安徽省工程技术研究中心，芜湖 241000)摘要：目的建立并优化费氏链霉菌的遗传操作体系，并通过分子改造得到新霉素效价提高的重组菌株，为后续获得新霉素高产菌株奠定理论基础。
方法选择费氏链霉菌最适产孢培养基和抗性筛选标记，对接合转移体系的关键影响因素进行优化，获得过表达neoC基因的重组菌株，以进一步研究neoC基因对新霉素效价的影响。
结果费氏链霉菌接合转移最适培养基为A75培养基，孢子最适处理条件为50℃热激10min，37℃预培养4h，最适供受比为10:1，安普霉素最适添加时间为15h，优化后接合转移频率提高了7.69倍，并得到了一株新霉素效价提高了22.29%的neoC基因过表达菌株SF-neoC。
结论成功建立并优化了费氏链霉菌的遗传操作体系，为后续基于费氏链霉菌分子改造的其它应用提供依据。
关键词：费氏链霉菌；接合转移；遗传操作；新霉素中图分类号：R978.1 文献标志码：AOptimization and application of genetic manipulation systemof Streptomyces fradiaeSun Jun-feng, Wang Shan, Liu Peng-fei, Xue Zheng-lian,Wang Zhou and Liu Yan (Institute of Biologic & Chemical Engineering of Anhui Polytechnic University, Microorganism Fermentation Engineering andTechnology Research Center of Anhui Province, Wuhu 241000)Abstract Objective To establish and optimize a genetic manipulation system suitable for Streptomyces fradiae, and to obtain a recombinant strain with increased neomycin titer through molecular modification. This study lays a theoretical foundation for the subsequent acquisition of high-yield strains of neomycin. Methods The optimal spore production medium and resistance selection markers of Streptomyces fradiae were selected, the key influencing factors of the conjugation system were optimized, and a recombinant strain over-expressing the neoC gene was obtained to further study the effect of the neoC gene on the neomycin titer. Results The optimal medium for Streptomyces fradiae conjugation was the A75 medium. The optimal spore treatment conditions were heat-shocked at 50℃ for 10min and precultured at 37℃ for 4h. The optimal ratio was 10:1. The optimal addition time of apramycin was 30℃ for 15h. After optimization, the conjugation frequency increased by 7.69 times. At the same time, we obtaineda neoC gene over-expressing strain SF-neoC with 22.29% increase in neomycin titer. Conclusion The genetic operation system of Streptomyces fradiae was successfully established and optimized, providing a basis for other applications based on the subsequent molecular transformation of Streptomyces fradiae.Key words Streptomyces fradiae; Conjugation; Genetic manipulation; Neomycin收稿日期：2020-02-10作者简介：孙俊峰，男，生于1994年，在读硕士研究生，主要研究方向为微生物资源开发与利用，E-mail:******************通讯作者，E-mail:********************新霉素(neomycin，Nm)是1949年于费氏链霉菌产物中纯化得到的一种氨基糖苷类抗生素[1-2]。
链霉菌育种方法与作用机制研究综述
紫 外线 是 一种 使用 时 间长 、 果好 。 效 诱发 设 备简 单 的诱 变 剂 。 大 多数 的高产 抗 生 素产 生 菌 都使 用过 紫 外线 诱变 绝 进 行 育种圈 通 常将 放 线 菌制成 孢 子悬 液 ， ３ 波 长稳 定 。 用 ０Ｗ 的紫 外灯 在 ３ ｍ 处 进 行 照射 ， 间用 磁 力搅 拌 器 对 悬 液 ０ｅ 期 进 行搅 拌 ， 其接 受均 匀 。 理 完成 后 ， 使 处 为防 止 回复 突变 ， 应
暗 处涂 布并 于 黑暗 培养 。 黄世 文等 【 淡 紫 色吸水 链 霉 菌进 句 对
简单 ， 安全 可 靠 。 微波 能 够刺 激菌 体 细胞 内水 分 、 白质 、 蛋 核 苷酸 、 碳水 化合 物 等极 性 分子 的快 速运 动 ， 种 快速 运动 所 这 引起 的摩 擦 可以 使 细 胞 内 Ｄ Ａ之 间 的氢 键 和碱 基 堆 积 力 Ｎ
Ｈｅ Ｎｅ 光对 生 物 的诱 变机 制在 于 红激 光能 提 高染 色 — 激 体 结 构 的机 能状 态 ， 加 有效 分裂 活性 ， 增 使细 胞处 于 易变 状 态 ， 过 多 光 子 的 吸收 而聚 积 能 量 ， 通 并进 行 再 分 配 而 引 起 Ｄ Ａ 分子 的损 伤和 突变 。 振倡 ［ Ｈｅ Ｎ Ｎ 吴 ９ １ 用 — ｅ激光 辐 照 龟 裂 链 霉 菌高产 株 单孢子 悬 液 ２ ｎ， 获得 高 产菌 株 ５ ２ ， ０ｍｉ 曾 ２ １ 其 发 酵 单 位 比 未 辐 照 菌株 提 高 了 ５ 此 外 ， 振 倡【还 首 次 ％。 吴 ｌ ｏ ｌ 报 道 了 应 用铜 蒸 气 激光 辐 照 龟 裂链 霉 菌 获得 高 产 辐 照 株 ． 其 产量 平 均提 高 了 １％以上 。 酵 单位 达 到国 际先 进水 平 。 ０ 发 吴 振倡 等ｆ报 导铜 蒸气 激 光辐 照金 霉 素链 霉 菌 ３ ｎ得 到 Ｉ 】 ｌ ０ｍｉ
链霉菌诱变育种方法综述
链霉菌诱变育种方法综述摘要：主要论述了链霉菌的4种诱变方法，即物理诱变、化学诱变、空间技术诱变和复合诱变。
同时对这4种方法的原理及具体操作方法进行了简要的阐述。
其中物理诱变中的紫外线诱变方法是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂。
化学诱变方法中的EMS、8-Mop、NTG和LiCI也取得了很好的效果。
近年来用宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空间站及航天飞机等空间飞行器，进行搭载微生物材料的空间诱变育种是培养新的生物菌种的一种有效方法。
将以上诱变方法结合起来使用，可取得更好的诱变效果。
关键词：链霉菌；育种；诱变放线菌是产生抗生素活性最大的一类微生物，迄今已在工业、医学、农业上都有利用抗生素成功的实例，而链霉菌又是放线菌中抗生素的主要产生菌，具有广泛的物种多样性和代谢多样性，是重要的资源微生物，但在链霉菌中普遍存在遗传不稳定性，而引起抗生素产量下降。
因此，各国学者不断研究提高抗生素产量的方法，已期获得更大产量的抗生素，而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。
诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法，因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。
本文就链霉菌诱变育种的几种方法做了简要论述。
1 物理因子诱变方法1．1 紫外线诱变法紫外线是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂，大约有80％的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。
具体操作方法是将斜面培养物制备成单孢子悬液或原生质体放在磁力搅拌器上，开紫外灯(3ow，距30cm)照射不同的时间后，涂平皿(为防止回复突变，紫外线诱变后的操作应在红灯下进行)进行培养，然后挑取不同形态的单菌落接斜面，进行摇瓶发酵筛选。
用此种方法，以土霉素产生菌龟裂链霉菌Lf-2为出发菌株，经过紫外线诱变后，筛选的菌株于出发菌株相比发酵效价提高了17．4％，发酵指数提高了23．9％。
黄世文等对淡紫色吸水链霉菌进行紫外线诱变，所获菌株发酵液对水稻纹枯病和恶苗病的抑杀效果比原始菌株明显提高，并且证实用菌悬液涂培养基之后先在28~C培养24 h，再在紫外灯下诱变菌株比涂后直接照射和直接照射菌悬液所获得的诱变菌株的生测效果好，这可能是微生物在培养24} 后，正处在分裂生长的初始阶段，当受到外部“能量”作用时较易发生变异。
硫酸二乙酯和紫外线对金霉素链霉菌的诱变育种
的研究成为一个热点［ ， ２ 在抗肿瘤、 Ｊ 抑制骨 吸收 、 促进
骨形成 、 进成纤 维 细胞附着 和扩 展 、 促 治疗痤疮 等方 面
起重要作用。这些非抗菌作用 的出现 ， 使四环素类抗 生 素增加 了新 的 临 床 应用 价 值 。本文 利 用 Ｄ Ｓ诱 变 Ｅ 和紫外线 诱 变的方法 ， 一生 产 水 平 的金 霉素 链 霉 菌 对 株进行诱变 ， 提高其生产能力。
摘要 ： 考察 了硫酸二乙酯（ Ｅ ） Ｄ Ｓ 和紫外线（ 、对 金霉 素链 霉菌进行诱变 的效果。其中 ２ Ｄ Ｓ 变剂 Ｌ ％ Ｅ诱
对金霉素链霉菌无明显的致死效应 ， 但在 含有 金霉 素 ２ ∞ ／ 的培养基上筛选 结果表明 ，Ｅ Ｄ Ｓ对金霉 素产生 菌 产生 了较强 的诱变效果 ， 菌株正突变率选 ５ ％：对金霉 素链 霉菌进行紫 外诱 变 的结果 表明 ， 营养贫瘠 培 ２ 在 养基上筛选 的诱变效果较 营养丰 富培养基上 的效果好 ， 且遗传特性稳定 ： 美麓 词 ： 金霉 素链霉菌 ； 硫 酸二 乙酯 ； 紫外线诱变 中圈分类号 ： ９３ Ｑ ３ 文献标 识码 ： Ａ 培养基 ； 金霉素
用 比色法 测定 。 Ｊ
２ １ Ｄ Ｓ对金霉 素链 霉 菌的致死 效应 和诱 变效应 ． Ｅ
水解物 、 牛内浸膏、 酵母粉 、 琼脂按比例配制 。 （）ｖ ７ ｕ 诱变中平皿再生培养基
基， 加入 一定 比例的琼脂 。
１２ 实验 方法 ．
抗生素生产能力同其产生菌 自身代谢产物 的高耐 受性 成 正相 关 关 系 。以 ７ ５×１０个／ ｌ ． ０ ｍ 孢子 数 的 孢
菌号
Ｐ ３Ｉ Ｐ２ ３ ４ ９
１ 材料与 方 法
１ １ 宴 验 ．
理 １后 ， ｈ 其余同对照。 １２２ 紫外诱 变 将 一 定 体积 的生产 菌 株孢 子悬 液 ．． 加入 磁 力 搅 拌 子 在 搅 拌 状 态 下 用 紫 外 灯 （ 长 波 ２３７ｍ 功率１Ｗ， ５ ｎ ， ５ 照射距离２ ．ｃ ） ８ ２ｍ 照射２ｓ其余步 ０，