昆虫基因工程
昆虫杆状病毒细胞表达系统 课件
6) Simplicity of technology
This technology has made expression of full-length proteins fast, easy and reliable. Recombinant Baculovirus can be obtained in two simple steps–cloning and co-transfection–in as little as 5 days. The ease of use now rivals that of bacterial expression systems and BEVS technology does not require that the recombinant protein be expressed as a fusion protein.
5) Capacity to express unspliced genes
Insect cells have the capability to perform intron/exon splicing. However, certain virus-, tissue- or species-specific splicing patterns will not be obtained if they require the presence of particular splicing factors which are not available in the infected insect cell environment. In general, for high protein expression levels, a cDNA insert rather than a genomic DNA fragment is recommended.
昆虫杆状病毒基因工程研究新进展
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基因工程在病虫害防治中的应用
基因工程在病虫害防治中的应用基因工程是一种利用分子生物学和遗传学技术，通过改变生物体的基因组来改良和创造新的生物体的方法。
在病虫害防治领域，基因工程可以为我们提供一种有效的手段，以减少对农作物和人类健康的危害。
本文将介绍几个基因工程在病虫害防治中的应用案例。
一、抗病毒基因的导入病毒是威胁农作物生产的主要因素之一。
传统的病毒防治方法主要依赖于化学农药，但这种方法存在着副作用，如环境污染和健康风险。
基因工程的出现为病毒防治带来了新的希望。
研究人员通过导入具有抗病毒能力的基因，使农作物能够免疫病毒的侵袭。
例如，将烟草嵌紋病毒（TMV）的外壳蛋白基因导入番茄，使得番茄能够抵抗TMV的感染。
这种抗病毒基因的导入方法具有较高的选择性和效果，可以有效地保护农作物免受病毒的威胁。
二、抗虫基因的导入昆虫是农作物生产中最常见的害虫之一。
传统的防治方法主要依赖于农药，但农药的使用存在一定的风险，如土壤和水源的污染，以及农药对益虫的不良影响。
基因工程的出现为解决这一问题提供了新的思路。
研究人员通过导入具有抗虫能力的基因，使农作物能够有效抵抗害虫的侵袭。
例如，将一种来自于松毛虫的杀虫蛋白基因导入玉米，可以使玉米抵抗松毛虫的攻击。
这种抗虫基因的导入方法可以减少对农药的依赖，达到可持续的病虫害防治效果。
三、基因编辑技术的应用基因编辑技术是一种高效的基因工程手段，可以精确地修改生物体的基因组。
在病虫害防治中，基因编辑技术可以被用于改良和创造抗病虫基因。
例如，利用CRISPR/Cas9技术，研究人员可以对植物基因组进行特定基因的敲除或编辑，从而使植物获得更强的抗病虫能力。
这种基因编辑技术具有高效、精准的特点，可以提供更多选择来对抗不同类型的病虫害。
四、生物杀虫剂的开发除了导入抗病虫基因外，基因工程还可以用于开发生物杀虫剂。
生物杀虫剂是指利用生物制剂来对抗害虫的一种方法。
通过基因工程技术，研究人员可以改良和合成一些特定的杀虫蛋白，使其具有更强的杀虫活性和选择性。
现代生物技术在环境科学中的应用
现代生物技术在环境科学中的应用环境科学是一门涉及多个领域和技术的综合性学科，其目的是保护和改善环境，以保障人类和地球的可持续发展。
现代生物技术是环境科学中一种重要的工具，通过应用基因、细胞、组织、器官等技术，可以有效地解决环境问题，提高环境质量。
现代生物技术包括基因技术、细胞技术、组织技术、器官技术等，这些技术已被广泛应用于环境科学领域。
例如，基因技术可以用于监测环境污染、筛选耐受性强的微生物，以及基因工程菌的构建等；细胞技术可以应用于污染物的降解和转化；组织技术可以用于生态修复和环境治理等方面；器官技术则可以应用于水生生物的养殖和污染水体的处理等。
现代生物技术在环境科学中的应用非常广泛，下面举几个例子。
基因技术可以用于监测环境质量，如检测水体中的重金属离子、有机污染物等。
基因技术还可以用于预测气候变化，例如通过研究植物基因组学，可以了解植物对气候变化的适应性，从而预测未来的气候变化趋势。
现代生物技术还可以应用于野生动物管理，例如通过研究动物的基因组，可以了解其遗传特征和生活习性，为保护和管理野生动物提供科学依据。
未来，随着科技的不断发展和进步，现代生物技术在环境科学中的应用前景将更加广阔。
例如，通过研究微生物的基因组学，可以更好地了解其在环境中的作用和功能，从而为解决环境问题提供新的思路和方法。
通过应用现代生物技术，还可以培育出更具有环境适应性的植物和动物物种，为生态修复和环境治理提供更好的帮助。
现代生物技术已成为环境科学中不可或缺的重要工具，其应用前景非常广阔。
通过应用现代生物技术，我们可以更好地了解和保护环境，为地球的可持续发展做出更大的贡献。
随着人类活动的不断发展，环境污染和生态破坏问题日益严重。
为了应对这些问题，现代生物技术正在逐渐应用于环境科学领域，为环境保护和修复提供了新的解决方案。
本文将介绍现代生物技术的概念和分类，以及在环境科学中的应用。
现代生物技术是指利用生物系统、生物过程和生物制剂等手段来研究、开发、生产和应用环境保护、资源利用、生态修复等领域的技术。
昆虫的基因工程和转基因技术
昆虫表观遗传学调控策略
要点一
表观遗传学概述
表观遗传学是研究基因表达的可遗传变化而不涉及DNA序 列改变的科学。这些变化包括DNA甲基化、组蛋白修饰、 非编码RNA调控等，它们可以影响基因的表达模式和细胞 命运。
THANKS
感谢观看
基因功能研究
通过基因敲除、基因沉默 等技术手段，研究昆虫基 因在生长发育、繁殖、代 谢等方面的功能。
昆虫基因工程发展历程
早期探索阶段
20世纪80年代，科学家们开始尝试将 外源基因导入昆虫细胞中，并观察其 对昆虫的影响。
转基因昆虫的应用
近年来，转基因昆虫在农业、医学等 领域的应用逐渐展开，为这些领域的 发展带来了新的机遇。
生态环境领域
前景展望
通过基因工程技术，研究昆虫与环境的相 互作用关系，为生态环境的保护和治理提 供科学依据。
随着基因编辑技术的不断发展和完善，未来 昆虫基因工程将在更多领域发挥重要作用， 为人类社会的可持续发展做出贡献。
02
昆虫转基因技术方法
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
药物生产或疫苗开发载体
重组蛋白表达
利用转基因昆虫表达系统生产重组蛋白，用于药物或疫苗的开发 。
昆虫细胞培养
培养转基因昆虫细胞，用于生产具有药用价值的生物活性物质。
昆虫杆状病毒表达系统
利用昆虫杆状病毒作为载体，在昆虫细胞中表达外源基因，生产药 物或疫苗。
替代实验动物模型
人类疾病模型
抗虫基因工程存在的问题及其解决策略
吴 方 丽 等 T植 物 抗 虫 基 因 工 程 存 在 的 问 题 及 其 解 决 前 提 下!采 用 定 点 诱 变 法 降 低 保 守 序 列 的 "# 含 量!增 加 植 物 偏 爱 密 码 子 的 含 量 等 !降 低 外 源 基 因 和 内 源 基 因 之 间 的 差 异 !使 外 源 基因的甲基化程度降低$
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用培育的关键$虽然害虫对转基因抗虫植物的抗 性 发 展 较 慢 !但 也 是 一 个 不 容 忽 视 的 问 题 $目 前 人 们解决或延缓害虫产生抗性的对策主要有以下几
点!以消 除 害 虫 产 生 耐 受 性 对 农 业 经 济 产 生 的 不 利影响$ &>= 启动子的选择
早 期 的 抗 虫 转 基 因 植 物 中!导 入 的 是 单 个 抗 性 基 因 !利 用 的 启 动 子 是 组 成 型 启 动 子 !这 种 启 动 子的 组成 型 表 达 特 点!使 得 抗 虫 基 因 在 植 物 生 长 的整个周期以及植物的各种组织中都得到了表
消灭害虫的生物技术方法
消灭害虫的生物技术方法随着人类对生态环境的破坏以及气候变化的影响，各种害虫的数量和种类愈发增多，在农业生产和城市生活中带来了严重的危害。
传统的化学农药虽然相对便捷有效，但也会给环境和人类带来不良影响，如何消灭害虫，同时也要保护生态环境和人类健康，是人类面临的紧迫问题。
而生物技术方法则提供了一种新的可持续发展的害虫控制方案。
生物技术方法消灭害虫的原理是利用害虫的生物学特性和生态相互关系，通过人为控制害虫的天敌和捕食者、利用寄生和病原微生物等方式来减少害虫数量，达到消灭害虫的目的。
生物技术方法既可以提高作物产量和品质，保障食品安全，又使生态环境更加健康，具有可持续性。
生物杀虫剂是利用生物学特性生产的一种天然杀虫剂，由生物学细菌、真菌、病毒、昆虫等生物制成。
这些生物性杀虫剂可以直接降低害虫的数量，同时也可以增加害虫的天敌和捕食者的数量，形成害虫减少或死亡的多重效应。
相比于化学农药，生物杀虫剂更加安全环保，不会像化学农药一样对环境和生态造成危害，并且不会产生人类健康问题，被广泛应用于现代农业中。
同时，生物杀虫剂具有较好的效果，可以有效控制一些难以根治的害虫，其持续的效果也比传统化学农药更长久。
除了生物杀虫剂外，引入天敌也是一种有效的生物技术方法消灭害虫的手段。
在生态系统中，害虫和其天敌之间存在着协同共生的关系。
通过增加害虫的天敌或者人为引入一些天敌来吞噬害虫，就可以有效地控制害虫的数量。
例如，人们通过引入寄生蜂来控制一些对作物危害严重的昆虫，寄生蜂寄生于昆虫卵或者幼虫体内，通过在体内产卵自然杀死昆虫卵或者幼虫从而实现控制。
另外，利用基因工程技术也是实现害虫控制的常见方法之一。
基因工程技术可以人为修改害虫基因，使其无法成熟或者无法长成，从而达到消灭害虫的目的。
目前，一些科学家正在研究生产一系列抗农业害虫的转基因作物，这些作物上的抗害虫基因可以产生一些天然毒素，可以杀死或者防止害虫咬食作物。
总的来说，消灭害虫是现代农业生产中一个重要的问题，传统的化学农药虽然能够在短时间内有效控制害虫，但对环境和人类健康会造成危害，同时也容易导致害虫的抗药性的产生。
昆虫细胞的培养综述
昆虫细胞培养及其应用进展摘要：随着生命科学的迅速发展，细胞工程愈来愈受到人们的重视。
以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值，已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。
本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展，包括昆虫细胞培养基研究开发：昆虫细胞系的建立和组织培养，利用生物反应器大规模培养昆虫细胞，昆虫细胞2杆状病毒表达系统，构建基因工程细胞系及其稳定性表达，以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。
关键词：昆虫细胞系；昆虫细胞培养；基因表达；培养条件昆虫的组织培养最早始于1915年，直到1962年Grace才成功建立了世界上第一个细胞系，此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展，不断有新细胞系建立的报道。
现在，昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。
1昆虫细胞培养基昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段.天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液.合成培养基最大的特点是各种成分已知•无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上，在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基.昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1]体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben 2dict (1915),但他当时没有合适的昆虫细胞培养基。
T rager首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件，目的是证明单个细胞能在体外存活几天，并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。
1956年Silver W yatt改进了用于家蚕（B om byx m ori L innaeus）蛹的培养基，成功地使细胞存活了14d。
他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21种氨基酸、5种盐、3种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖，并相应调解了pH 值和渗透压，这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。
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制作人：凌发忠
主要内容
以发育分子生物学研究模型及P元件转化为 特征的果蝇系统 以修饰改良物种及转座子转化为特征的蚊 虫和农业害虫系统 以表达异源功能蛋白及病毒转染为特征的 家蚕系统
6.1 果蝇的基因转化系统
6.1.1 果蝇转座元件 的结构及特征
Copia因子
FB家族 P元件
杆状病毒的表达载体系统
杆状病毒表达载体的常用四种启动子
1 多角体蛋白编码基因启动子（polh-P) 2 P10蛋白编码基因启动子（p10-P) 3 融合或修饰启动子（p39-P-Pn) 4 家蚕丝心蛋白编码基因启动子
BmNPV的表达系统的优点
1 在多角体蛋白编码基因的强启动子介导下，外源
果蝇转座元件P元件的结构与特征
结构
属于一个家族，含有31bp的末端反向重复序列。 转座时在靶DNA上产生8bp的正向重复序列，不同 的P元件所含有的开放阅读框数量不同。
特征
P元件转座能力的激活具有组织特异性，只发生 在生殖细胞中，但是P元件中转座酶的的编码序 列却是在生殖细胞中和体细胞中都能转录。
6.2.2 用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记
颜色标记
色素基因：野生型基因突变所形成的等位基因影响眼睛色 素的合成
眼睛颜色标记，例如 地中海蝇的white基因等
存在的问题
尽管控制眼睛颜色基因的发现和鉴定有助于显性标记系统的 建立，但如果没有突变的宿主细胞怎么筛选？
显性筛选标记
1 化合物或药物抗性基因
实验证明，唾液腺和中肠结合肽（SM1）能强烈 抑制疟原虫横跨唾液腺和中肠上皮细胞。 Junitsu Ito等人构建一种驱动系统以表达能抑制 疟原虫发育的基因。
6.3 家蚕的基因表达系统
6.3.1 家蚕的分子生物学
基础工作
1 28条染色体，500kb的遗传连锁图谱 2 450Mb的全基因组 3 16948个完全基因和7285个基因片段 4 鉴定功能）的序列分析
典型基因
1 雄性特异性表达的基因 2 性别决定基因
6.2.3.2 条件致死型转基因株的构建
1 四环素抗性操纵子基因表达系统 特征：目的基因的表达取决于抗生素的存在与否、 转录激活因子的性质及其产生的调控机制 2 酵母Gal4-UAS二元基因表达系统
特征：Gal4能促进UAS下游的目的基因表达，若 UAS下游有适当的致死基因则可达到目的
P元件转录产物的剪切模式
体细胞内剪切模式
只有前两个内含子被切除， 形成一个ORF0-ORF1-ORF2的 编码区，获得66kD的蛋白质 是P元件转座活性的阻遏物
生殖细胞内剪切模式
把3个内含子全部切除，从 而连接4个阅读框，形成的 mRNA被翻译成87kD的转座酶， 可通过一种非复制型的方式 进行转座。
基因高效表达
2 对脊椎动物和其他昆虫是安全的 3 双链环状的病毒基因组结构易重组操作 4 修饰加工系统接近于哺乳动物 5 重组BmNPV分子可以在蚕体和细胞培养物内表达
6.3.3 家蚕生物反应器的构建
原理
BmNPV基因组是超螺旋的闭环双链DNA，多角体蛋 白基因不是病毒复制的必需基因，它在感染晚期高效表达， 其编码的多角体蛋白只起包埋病毒粒子的作用，与病毒的 感染没有直接的关系。 多角体蛋白基因即使部分或全部被外源基因取代，仍 能形成有感染性的病毒粒子，根据这一特性，将外源基因
P元件介导的基因转移操作程序
6.2 蚊虫和农业害虫的基因改造系统
害虫的治理
杀虫剂---------对环境造成不可逆的污染
转基因植物----食品安全性的担忧
分子遗传学家的设想
昆虫不育技术，“以虫治虫”
6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体
6.2.1.1用于 非果蝇类昆 虫转化的转 座元件
发育循环过程
6.3.2.2 杆状病毒的基因组结构
四类功能基因
1 结构蛋白编码基因 2 DNA复制及基因表达调 控基因 3 与宿主相互作用的基 因 4 酶蛋白基因
6.3.2.3 杆状病毒的基因表达调控
早早期，约感染0-3h,基因表达依赖宿主基因表达产物。 迟早期，约3-6h，基因启动依赖早早期基因产物，表达产 物包括病毒DNA复制所必需的蛋白。 晚期，约6-10h,DNA复制启动，同时合成BV装配所需的 结构蛋白，产生成熟的BV粒子。 晚晚期，约10h后，合成的蛋白是装配加工OV粒子并包 埋入包涵体所必需的。
抗病原体传播的转基因蚊虫至少 满足两个条件才具备实用价值：
1.具有与野生型同伴的交配竞争优势。 2.它们所携带的优良转基因能稳定有效地 垂直传递到子代。
6.2.4.2 疟疾蚊虫的基因工程
蚊虫是疟疾传播必需的媒介。
疟蚊从受感染的宿主吸血后，疟原虫的配子母细 胞转化成配子，后者交配后形成合子，再发育成 动合子。动合子横跨疟蚊的中肠上皮细胞时，疟 原虫在疟蚊中的发育过程全部结束。
通过基因操作技术替换BmNPV基因中的多角体蛋白基因，
从而使重组BmNPV在蚕体细胞内大量表达外源蛋白。
BmNPV系统表达外源基因示意图
操作流程 目的基因插入转移 载体。 目的基因转移到病 毒基因组靶位点， 空斑纯化获得重组 病毒。 重组病毒感染宿主 培养细胞或幼虫。
利用家蚕BmNPV载体表达的外源重组蛋白 人类胰岛素样生长因子Ⅱ 人和小鼠白细胞介素－３ 日本脑炎病毒膜蛋白gp120和gp41 艾滋病毒核心蛋白等等
2 绿色荧光蛋白（GFP）基因 3 改良的GFP标记系统
6.2.3 农业害虫的基因工程
目标
1 借助共生细菌或病毒
2 构建具有交配优势且能使害虫子代绝育的转基因株 3 构建在特定条件诱导下使子代自戕的害虫转基因株
6.2.3.1 分子绝育型转基因株构建的基因资源
原理
筛选可操作性靶基因，该基因可破坏害虫的生殖 系统或使害虫子代只产生单一性别的子代，进而 表现不可发育的遗传表型。
6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序
经典实验的验证
1982年，A.C.Spradling和G.M.Rubin,证实若质 粒含有P元件，将该质粒注射到果蝇M型雌性果蝇 的胚胎中，可实现基因转移。
P元件介导的果蝇转化条件 1 受体细胞内存在转座酶 2 存在反向重复序列及其邻近的亚末端序列
家蚕表达系统难以产业化原因
主要原因： 无论是重组家蚕细胞培养物还是转基因幼 虫，一般都会在病毒感染后的4-5天内裂解 死亡，导致外源基因活性产物的表达时间 比较短，难于组织规模化生产。 克服困难的关键是建立一套重组家蚕细胞 的连续培养系统。
Minos
Hermes mosl piggyBac
转座方式的不利因素 1 昆虫物种有限 2 产卵数量有限 3 卵细胞难以渗透
思考： 如何得到基因传播速度快，有且只有在昆虫体细胞 中表达的转化载体？
6.2.1.2 用于非果蝇类昆虫转染的病毒
1 昆虫逆转录病毒 例如：gypsy具有感染和转座双重性，一般转座 效率高于转染效率 2 浓核病毒
3 温度敏感型致死系统 特征：携带温度敏感型致死基因的个体在18摄氏 度时被冻死
四环素抗性操纵子基因表达系统
6.2.4 蚊虫的基因工程
6.2.4.1 蚊虫转基因技术的基本战略
进展
蚊虫转化的主要研究焦点是再生能抗疾病传播的蚊子。 实验发现，有些蚊虫包裹从中肠上皮细胞进入血管内腔的 疟原虫的能力增加，进而确定蚊虫免疫系统中某些基因可 作为构建抗病原体转基因蚊的靶基因。 目前，利用转基因技术构建阻断病原体传播的转基因蚊虫 取得了重要的进展。 例如：含有登革热病毒包衣蛋白反义基因的SIN病毒能导 致受感染的蚊虫体内登革热病毒颗粒显著减少。
6.3.2 基于杆状病毒的家蚕基因表达系统
杆状病毒的生物学特征
1 宿主只限于无脊椎动物，主要是昆虫纲的7个目 2 包涵体杆状病毒重要科属包括NPV（核型多角 体病毒）和GV（颗粒体病毒），GV比NPV小 3 NPV的病毒颗粒在多角体里的数目不同分为单 粒包埋型病毒和多粒包埋型病毒 4 杆状病毒的发育循环含有两个独特的时期。即 BV（出芽型病毒）和OV（包埋型病毒）
既可感染控制害虫，又可作为外源基因的运载工 具，但感染的宿主范围比较窄 3 新培斯RNA病毒
可高效感染蚊子成虫细胞，且支持RNA高效转录 及蛋白质合成
6.2.1.3 用于非果蝇类昆虫转染的共生生物
共生转基因技术：利用合适的共生生物在昆虫 中表达外源基因。
1.节肢动物体内的Wolbachia（沃尔巴克氏体） 当感染力Wolbachia的雄性昆虫与非感染型的雌性 昆虫交配后，其子代具有不育或部分不育特征；而受 感染的雌性昆虫与任何性质的雄性昆虫交配，其子代 具有生育力。因此，受感染的雌性昆虫具有独有的繁 殖优势。 试想带有某种有益特征的Wolbachia去感染少数昆 虫，便可将有益特征迅速传播到整个昆虫种群。 但目前还缺少有效地转化程序。 2.寄生在接吻臭虫（Rhodnius prolixus）体内的 Rhodococcus rhodnii
6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育
果蝇中有一种遗传学 现象：
• P品系雄果蝇与M 品系雌果蝇杂交后 代不育。 • M或P品系雄果蝇 与P品系雌果蝇杂 交后代可育。
转座子在此过程中的作用
• P元件（P element）存在于P品系黑腹果蝇中，而M 品系中缺乏。 • 当P雄性与M雌性杂交时， P元件在其杂交后代的性细 胞中被激活，从而产生了编码转座酶的序列。 • P元件也产生转座的阻抑物，它是雌蝇细胞质遗传。P 型雌蝇细胞质遗传产生转座阻抑物，阻止了P元件的 转座。